La maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a frustré de nombreux travailleurs de la santé au début de la pandémie, non seulement en raison de son taux de transmission élevé, mais en raison du manque de traitements efficaces contre le syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2 (SARS-CoV-2), le agent causal. À ce stade de la pandémie, les seules options de traitement pour les personnes atteintes de COVID-19 sévère comprenaient l’oxygène supplémentaire ou la ventilation mécanique invasive.
Dans un récent Protéine & Cellule étude, des chercheurs de l’Université de Hong Kong identifient un composé potentiellement efficace contre le COVID-19.
Étude: Cibler la protéase de type papaïne pour l’inhibition à large spectre des coronavirus. Crédit d’image : Treecha/Shutterstock.com
Sommaire
Sélection d’inhibiteurs potentiels de PLpro
Un écran à haut débit basé sur la fluorescence ciblant l’activité de clivage de la protéase de type papaïne de la polyprotéine protéolytique du SRAS-CoV-2 (PLpro) a été utilisé pour identifier les inhibiteurs potentiels de PLpro. Le DTT a été incorporé dans tous les tests pour favoriser la découverte d’inhibiteurs non covalents.
Le criblage initial consistait en 50 080 composés de type médicamenteux dans des plaques à 384 puits. Avec un niveau de coupure de 40 % d’activité inhibitrice vis-à-vis de PLpro, 54 hits primaires ont été découverts.
Une série d’essais de confirmation et secondaires ont ensuite été utilisés pour exclure les sources potentielles d’interférence, telles que la fluorescence de la 7-amino-4-méthylcoumarine (AMC), suivies d’expériences de validation dose-dépendantes contre PLpro du SRAS-CoV-2 et de son proche coronavirus relatif du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV).
Trois composés contre le SRAS-CoV-2 présentaient un intérêt particulier, tous inclus dans la même classe de 5-oxo-1-thioxo-4,5-dihydro[1,3]thiazolo[3,4-a]quinazoline-3-carboxamides. Ceux-ci ont été nommés FO213, FO326 et FO393 et présentaient des concentrations inhibitrices de 50 % (CI50) de 7,4, 8,2 et 15,8, umol/L respectivement, et inhibaient le MERS-ProPL avec une CI50 entre 10 et 20 umol/L. Un autre composé, GRL0617, était efficace contre le SARS-ProPL mais s’est avéré inefficace contre la variante MERS-CoV-2.
Interaction entre F0213 et SARS2-PLpro ou MERS-PLpro. (A) Amarrage F0213 à SARS2-PLpro. Gauche, surface moléculaire de SARS2-PLpro (cyan coloré) avec GRL0617 (or coloré, PDB : 7JRN) et F0213 (magenta coloré, modèle d’amarrage) montré dans le modèle de bâton. La fente de liaison au substrat et la boucle BL2 près du site actif sont indiquées. Milieu, modèle de ruban de SARS2-PLpro avec souris liée ISG15 (jaune coloré, PDB : 6YVA). L’extrémité C-terminale de mISG15 est représentée avec le modèle de bâton. Le mode de liaison prédit de F0213 (magenta) est montré avec le modèle de bâton. À droite, interaction détaillée entre F0213 et SARS2-PLpro ; les résidus ont été prédits pour interagir avec l’inhibiteur sont montrés avec les modèles de bâton (bleu). (B) Inhibition in vitro de WT et du mutant SARS2-PLpro par F0213. Une concentration fixe de PLpro (0,1 µmol/L) et 5 µmol/L de substrat RLRGG-AMC ont été incubés avec du F0213 dilué en série. ANOVA bidirectionnelle par rapport au % d’inhibition WT de chaque concentration de F0213. (C) Expériences de calorimétrie de titrage isotherme (ITC) pour la liaison entre SARS2-PLpro et les inhibiteurs comme indiqué. Constante de dissociation Kré est indiqué; ND signifie non détectable. (D) Amarrage F0213 à MERS-PLpro. À gauche, le modèle de ruban de MERS-PLpro (coloré en bleu clair) lié par l’ISG15 humain (coloré en jaune, PDB : 6BI8) est recouvert du mode de liaison prédit de F0213 (coloré en magenta). La boucle BL2 est indiquée. À droite, interaction détaillée entre F0213 et MERS-CoV PLpro ; les résidus qui devaient interagir avec l’inhibiteur sont indiqués avec les modèles de bâtonnets et colorés en bleu. (E) Inhibition in vitro de WT et du mutant MERS-PLpro par F0213. ANOVA bidirectionnelle par rapport au % d’inhibition WT de chaque concentration de F0213. (F) Expériences ITC pour la liaison entre MERS-PLpro (WT ou mutant) et les inhibiteurs comme indiqué. Constante de dissociation Kré est indiqué; ND signifie non détectable. (G) Le virus recombinant portant la substitution E271A dans MERS-CoV NSP3 confère une résistance à F0213. Les cellules VeroE6 ont été infectées par le MERS-CoV de type sauvage ou mutant généré par génétique inverse. Les activités antivirales ont été déterminées par essai sur plaque détectant la particule virale vivante dans le surnageant. Les résultats sont présentés sous la forme du rapport entre les groupes traités par F0123 et traités par le véhicule qui ont été infectés par le même virus. ANOVA à deux facteurs. Pour toutes les analyses statistiques, ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01,*P < 0,05
Efficacité des inhibiteurs de PLpro contre le SARS-CoV-2 et le MERS
Alors que les trois composés FO étaient efficaces contre le SRAS-CoV-2 seul, seuls FO2123 et FO326 étaient efficaces à des concentrations non toxiques. Comme FO213 avait la concentration efficace la plus faible de 50 % (EC50) contre les deux coronavirus, il a été choisi pour une caractérisation plus poussée.
La coloration par immunofluorescence des antigènes SARS2-NP ou MERS-NP a révélé une inhibition significative de la réplication virale après le traitement au FO213. Cependant, GRL0617 était un mauvais suppresseur dans les cellules Vero E6 infectées.
L’efficacité antivirale du FO213 contre les variantes préoccupantes du SRAS-CoV-2 (COV) a été évaluée par des tests de réduction de plaque à l’aide des variantes Alpha, Beta, Delta et Omicron. À cette fin, FO213 a réussi à supprimer la réplication de toutes les variantes de manière dose-dépendante.
Une étude plus approfondie sur des cellules embryonnaires humaines dérivées de cardiomyocytes a confirmé la capacité de FO213 à réduire de manière significative les rendements viraux dans des cellules plus pertinentes sur le plan physiologique. Les tests de réduction de la charge virale pour les coronavirus apparentés ont montré des résultats similaires, le FO213 présentant une activité anti-coronavirus à large spectre.
Pharmacodynamie du FO213
Pour une étude plus mécaniste de FO213, l’activité de clivage de PLpro contre les substrats ubiquitine-AMC et ISG15-AMC a été titrée contre différentes concentrations de FO213. MERS-PLpro avait tendance à montrer une sensibilité plus élevée que la version SARS-CoV-2 ; cependant, le composé est resté efficace.
Les enzymes humaines de déubiquitination, qui sont celles qui sont attaquées par PLpro, ont été isolées à partir de lysats cellulaires et modifiées par une sonde HA-Ub vinyl sulfone en présence et en absence de FO213. pour permettre une analyse Western blot avec un anticorps antiHA pour révéler toute modification. Cependant, le traitement avec un inhibiteur de contrôle positif a diminué la modification dans la mesure où aucun changement n’a été mesuré lors du traitement au FO213.
Lorsque PLpro a été ajouté au lysat, la modification s’est produite ; cependant, cela a également été immédiatement éliminé si FO213 était présent, suggérant ainsi que FO213 est un inhibiteur de désubiquitination spécifique du SARS-2PLpro. Une exploration plus poussée contre plusieurs autres protéases cellulaires a confirmé cette observation.
Efficacité du FO213 in vivo
Lors d’essais sur des animaux, des hamsters syriens dorés ont reçu une administration orale ou intrapéritonéale de 5 mg/kg de FO213, la première dose étant administrée six heures après l’infection, puis quotidiennement pendant les trois jours suivants. Les charges virales ont culminé le quatrième jour ; cependant, FO213 a réussi à réduire les unités formant plaque dans les tissus pulmonaires de 1 à 2 log. Un degré similaire de suppression a été observé dans les poumons des hamsters traités.
La coloration par immunofluorescence a montré que les hamsters traités au FO213 présentaient une expression considérablement réduite de la protéine de la nucléocapside (N) du SRAS-CoV-2 dans les poumons, les lésions pulmonaires chez les hamsters traités étant beaucoup moins graves.
Des souris knock-in avec une dipeptidyl peptidase humaine létale ont ensuite été provoquées avec 2 000 unités formant plaque (PFU) de MERS-CoV adapté à la souris, suivies d’une administration intrapéritonéale de FO213. Les souris traitées au FO213 avaient un taux de survie significativement plus élevé à 40 % par rapport à 0 % et ont subi une réduction beaucoup plus faible de la perte de poids corporel que les souris non traitées.
conclusion
Les auteurs ont identifié avec succès plusieurs composés anti-SARS-CoV-2 efficaces à partir d’une bibliothèque massive, confirmé leur efficacité dans des études cellulaires, déterminé un mécanisme d’action probable qui permet à ce composé d’être efficace et confirmé que FO213 est efficace contre COVID-19 in vivo. Pris ensemble, les résultats de l’étude actuelle soutiennent l’utilisation future de ce composé dans les essais cliniques.
