Depuis le début de l’épidémie mondiale de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), plus de 76 millions de personnes ont été infectées, avec plus de 1,68 million de décès. Le virus à l’origine de cette pandémie est le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), l’un des sept coronavirus pathogènes à avoir frappé le monde jusqu’à présent. Alors même que les premiers vaccins sont déployés, la recherche de traitements spécifiques et sûrs est toujours en cours, à mesure que de nouvelles variantes apparaissent, forçant de nouveaux verrouillages dans plusieurs régions.
Une nouvelle étude pré-imprimée sur le bioRxiv * serveur démontre la capacité d’un inhibiteur d’acide gras synthase à améliorer la survie des souris infectées par le virus de l’hépatite murine. Ce faisant, il ajoute à la somme des connaissances sur la relation du SRAS-CoV-2 avec le métabolisme du cholestérol dans la cellule hôte.
Sommaire
Objectifs de l’étude
Les coronavirus ciblent plusieurs tissus de l’hôte humain, y compris les poumons et les cellules des voies respiratoires supérieures, les tissus intestinaux, les reins et le foie. Ils se lient aux cellules hôtes via les récepteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) et peut-être d’autres récepteurs tels que la neuropiline-1 (NRP1). Une fois que le virus se fixe au récepteur ACE2, le clivage protéolytique se produit à l’aide de protéases de la cellule hôte. Cela génère un fragment S2 qui est concerné par la stimulation de la fusion membranaire des cellules virales-hôtes, permettant au virus d’entrer dans le cytosol.
La plupart des thérapies potentielles ciblent cette étape de liaison. À l’heure actuelle, certains composés phares prometteurs comprennent des inhibiteurs de protéase et des molécules ACE2 solubles qui agissent comme des leurres, empêchant le virus de s’engager sur les récepteurs des cellules hôtes. Le taux élevé de mutation des virus à ARN de sens positif leur donne un avantage en leur permettant d’éviter l’inhibition spécifique provoquée par ces molécules.
L’étude actuelle visait à comprendre comment développer un antiviral à large spectre qui cible les aspects fondamentaux de l’interaction hôte-virus. Cela pourrait également aider à lutter contre les futurs coronavirus. L’étude actuelle a examiné la possibilité d’utiliser un inhibiteur de la palmitoylation pour traiter l’infection par le SRAS-CoV-2.
Palmitoylation du pic nécessaire pour les nouveaux virions
Des rapports antérieurs ont montré qu’une protéine appelée palmitoyltransférase ZDHHC5, avec son partenaire de liaison Golga7, interagissait avec la protéine de pointe du SRAS-CoV-2. Leur recherche, qui a utilisé la purification par affinité et la spectrométrie de masse, a suggéré que la queue de la protéine de pointe, qui se trouve dans le domaine cytosolique, subit une palmitoylation après sa génération dans la cellule hôte. Ceci est similaire au processus qui se produit avec le virus de l’hépatite murine (MHV), dont la protéine de pointe doit avoir une palmitoylation C-terminale pour que la réplication virale se déroule avec succès.
Si la palmitoylation est empêchée, la protéine de pointe ne peut pas être assemblée en de nouveaux virions. La protéine de pointe mutante était également incapable de stimuler la fusion membranaire pour former une syncytie par fusion cellule-cellule, contrairement au virus de type sauvage.
Plusieurs sites de palmitoylation
Dans de nombreux coronavirus qui infectent à la fois les cellules humaines et murines, les domaines C-terminaux ont montré un enrichissement en résidus cystéine dans les 20 derniers résidus, près de la membrane. Avec le SARS-CoV-2, 10 des 20 premiers résidus sont de la cystéine, ce qui laisse beaucoup d’espace de palmitoylation.
Les chercheurs ont utilisé des cellules HEK293T, leur permettant d’exprimer la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 étiquetée avec un épitope C9 à l’extrémité C-terminale. Ils ont découvert que ces cellules contenaient un certain nombre d’espèces de protéines de pointe, certaines de pleine longueur, certaines comprenant la sous-unité S2 et certains multimères de la protéine de pointe.
Ces cellules ont ensuite été cultivées en présence d’un composé donneur analogue de palmitate, appelé acide 15-hexadécynoïque (15-HDYA). Les chercheurs voulaient savoir si cet analogue de palmitate pouvait être lié de manière covalente à la protéine de pointe, qu’il s’agisse de l’espèce pleine longueur, S2 ou multimérique.
Ils ont ensuite utilisé l’échange d’acyl-polyéthylène glycol (PEG) (APE), une méthode qui consiste à remplacer chaque groupe palmitoyle de pointe pour une étiquette de masse PEG de 5 kDa. Cela aiderait à mesurer la quantité de palmitoylation qui se produirait par protéine. Ils ont découvert que la protéine de pointe pouvait être modifiée sur de nombreux sites. En regardant les protéines individuelles, il y avait au moins quatre groupes palmitoyle.
La palmitoylation de Spike est nécessaire pour la fusion cellule-cellule. (A) Western blot de SRAS-CoV-2 Spike-C9 des dix mutants Cys à Ser. (B) Immunofluorescence de SARS-CoV-2 Spike et le mutant SpikeC-> S-C9. Barres d’échelle, 10 um (C). Co-culture de cellules HEK exprimant Spike-C9 et ACE2 forment le syncytium. Les cellules HEK293T co-transfectées avec mCherry-C1 (magenta) et SARS-CoV-2 Spike-C9 (gauche et milieu) ou SARS-CoV-2 SpikeC-> S-C9 (droite) ont été co-cultivées avec des cellules transfectées avec EGFP- C1 (gauche, cyan) ou et myc-ACE2 (milieu, droite). Barres d’échelle, 20 µm. Les pointes de flèche indiquent les cellules fusionnées.
Palmitoylation requise pour la formation de syncytia
Ensuite, ils ont utilisé une technique pour induire une mutagenèse dirigée pour convertir les dix résidus cystéine en sérine à la place. Ils ont utilisé la microscopie à fluorescence pour déterminer si les cellules à pointe C9 et les protéines à pointe cystéine> sérine étaient également capables de catalyser la fusion cellule-cellule avec des cellules exprimant ACE2. Comme prévu, ils ont constaté que de nombreuses grandes syncyties se sont formées avec le pic-C9 mais pas avec la variante cystéine> sérine du pic. «Les résultats démontrent que les résidus Cys sont nécessaires pour que la protéine Spike facilite la formation de syncytium.»
La désactivation de ZDHHC5 réduit la formation de plaques virales
Dans le génome humain, il existe 23 ZDHHC (palmitoyltransférases contenant un domaine Asp-His-His-Cys à doigt de zinc, dont seule la ZDHHC5 palmitoyle la protéine de pointe de SARS-CoV-2. Afin de savoir si la suppression de ce gène serait efficaces pour limiter la propagation virale en culture, ils ont utilisé un virus moins létal, le CoV 229E humain, qui était approprié pour travailler avec un niveau de biosécurité 2. Il a une queue cytosolique qui ressemble à celle du SRAS-CoV-2 et peut être palmitoylé sur plusieurs sites Comme le pic SARS-CoV-2, le pic 229E est capable de palmitoylation ZDHHC5.
En utilisant un test cellulaire pour 229E avec ZDHHC5 silencieux, ils ont trouvé que moins de plaques étaient formées par rapport aux témoins. Pour déterminer si cela était dû à une infection altérée ou à une propagation ultérieure de l’infection à travers la monocouche de cellules, ils ont incubé les cellules avec le virus en culture liquide. Cela a montré que ZDHHC5 est nécessaire, non pas pour l’infection initiale, mais pour l’assemblage et la libération de particules virales infectieuses.
L’inhibition du FASN a empêché la palmitoylation du pic du SRAS-CoV2
Il n’y a pas d’inhibiteur spécifique de la ZDHHC5 à l’heure actuelle, mais l’inhibiteur de la synthase d’acide gras (FASN), la cérulénine, bloque l’ajout de palmitoyle à NOD1 et NOD2, qui sont des substrats de ZDHHC5. Puisqu’il s’agit d’un composé toxique, ils ont testé une autre molécule inhibitrice du FASN, appelée TVB-3166, et du bromopalmitate, un inhibiteur non spécifique des enzymes ZDHHC. Ils ont constaté que la palmitoylation de pointe était réduite pour les deux virus, tandis que dans les dosages unitaires formant des plaques, le nombre de plaques formées par 229E était de 86% inférieur.
Un inhibiteur du FASN augmente la survie des souris infectées par le MHV
Le composé TVB-3166 peut être administré par voie orale, et les chercheurs l’ont testé chez des souris infectées par le virus 229E. Ils ont constaté que si les souris témoins présentaient des signes de maladie dans les deux jours suivant l’infection, qui continuait à progresser, les souris traitées ont survécu pendant de plus longues périodes et beaucoup ont survécu. «Les résultats démontrent que la réduction des niveaux de palmitoyl-CoA est bénéfique pendant l’infection par le CoV car cette réduction favorise la survie des souris.»
Implications et orientations futures
L’étude suggère donc que la palmitoylation de la sous-unité S2 est essentielle pour la fusion membranaire virale, dans les virus SARS-CoV-2, MHV et SRAS. Dans le MHV, en effet, le pic de palmitoylation est nécessaire pour lui permettre d’interagir avec la protéine membranaire qui lui permet d’assembler le pic dans les nouvelles particules virales. L’ajout de TVB-3166, que ce soit dans des dosages cellulaires ou chez des souris infectées, a réduit la production de nouvelles particules virales infectieuses et augmenté la survie des souris.
Le mécanisme d’action de cette molécule souligne le rôle de l’altération du métabolisme lipidique dans les infections à coronavirus. Certains signes en sont des modifications des apolipoprotéines et des lipides sériques, ainsi qu’une augmentation des taux d’acides gras libres. Ces changements lipidiques peuvent favoriser la réplication virale. Il existe également une poche de liaison à l’acide linoléique dans l’ectodomaine du SRAS-CoV-2, ainsi que d’autres coronavirus pathogènes, indiquant la nécessité de recherches sur la manière dont les acides gras et le métabolisme des lipides sont liés à l’infection à coronavirus.
D’autres études pour tester le rôle thérapeutique possible du TVB-2640, un inhibiteur apparenté du FASN qui fait déjà l’objet d’essais cliniques pour le cancer et les maladies hépatiques non alcooliques, est disponible par voie orale et bien toléré chez les patients. Puisque le FASN est une enzyme hôte, il est peu probable que des mutations d’échappement virales apparaissent. «L’identification et l’approbation d’un traitement ou d’une prophylaxie pan-CoV par voie orale seraient bénéfiques à court terme et à l’avenir contre d’autres CoV zoonotiques.»
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.
