Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de prétirage, les chercheurs ont visualisé le mécanisme d’action et d’inhibition de la protéine non structurale 13 (NSP13) du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2) à une résolution spatio-temporelle élevée.
Sommaire
Arrière plan
Parmi les 15 NSP du SRAS-COV-2, NSP13, une hélicase d’acide ribonucléique (ARN), est essentielle à sa réplication. Cependant, il n’existe actuellement aucun antiviral approuvé ciblant nsp13. Contrairement aux protéines structurelles du SRAS-CoV-2, la séquence d’acides aminés de nsp13 est l’une des plus conservées parmi de nombreuses espèces de coronavirus (CoV) (par exemple, le syndrome respiratoire du Moyen-Orient CoV) et les variantes préoccupantes du SRAS-CoV-2 (COV), y compris Omicron. Ensemble, cela fait de nsp13 une cible antivirale à large spectre attrayante avec le potentiel de lutter contre les futures épidémies de CoV.
Des études structurales et biochimiques ont proposé que nsp13 soit une hélicase à ARN de la superfamille 1B (SF1B). Il utilise un mécanisme d’inchworm pour la translocation le long de substrats d’acide nucléique (NA) simple brin (ss) par lesquels nsp13 déroule probablement les duplex NA. Compte tenu de sa petite taille de pas, les techniques à molécule unique n’ont pas été en mesure de déchiffrer la vitesse à laquelle nsp13 marche le long de son substrat NA. Une telle résolution pourrait faire la lumière sur la façon dont les molécules inhibitrices affectent leur fonctionnement.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont développé des pincettes nanopores à résolution picométrique à molécule unique (SPRNT) pour mesurer les étapes du mouvement SARS-CoV-2 nsp13 sur les brins d’ADN. De plus, ils ont démontré comment SPRNT pouvait être utilisé pour déterminer le mécanisme d’action d’un inhibiteur d’hélicase. L’équipe a conçu un seul Mycobacterium smegmatis nanopore de la porine A (MspA) dans une bicouche phospholipidique. Une tension appliquée à travers cette membrane a provoqué le passage d’un courant ionique à travers le nanopore, qui a attiré du NA chargé négativement à travers le pore.
Différentes bases NA dans le nanopore ont provoqué des blocages de courant ionique uniques, qui pourraient être décodés dans la séquence NA. Une hélicase liée au brin NA capturé viendrait se reposer au bord du pore et tirerait le NA, ce qui entraînerait des étapes séquentielles de courant ionique. L’équipe les a résolus en étapes d’un seul nucléotide sur des échelles de temps inférieures à la milliseconde pour observer le mouvement de l’hélicase le long de NA. Simultanément, ils ont déterminé la séquence NA du substrat dans l’hélicase.
Il convient également de noter que SPRNT a appliqué une force proportionnelle à la tension appliquée sur le complexe enzyme/NA, qui a assisté ou résisté au mouvement nsp13 en fonction de l’extrémité du nanopore NA était liée. De plus, l’équipe a observé le mouvement de NSP13 le long des AN en présence de l’inhibiteur de l’adénosine triphosphatase (ATPase) ATPγS.
Résultats de l’étude
Les chercheurs ont enregistré 2413 événements individuels de translocation et de déroulement de NSP13 et 27 641 pas d’hélicase. Les résultats de l’étude ont confirmé que NSP13 a transloqué à ~ 1000 nucléotides par seconde le long de l’ADNss et des duplex d’ADN déroulés à une vitesse de ~ 100 paires de bases par seconde. Le taux de translocation NSP13 dépendait de l’ATP, avec le taux de réaction maximal (Vmaximum) allant de 600 à 3000 s−1 et constante de Michaelis (Km) allant de 100 à 700 µM pour l’ATP, selon le contexte de séquence sous-jacent au sein de NSP13. Des variations aussi importantes des taux de translocation à différentes positions d’ADN ont indiqué que l’identité de la base de NA affectait la cinétique de translocation de NSP13.
Les résultats de l’étude ont également montré que le complexe NSP13-ADN était moins stable et plus facilement délogé par l’application de la force. La variation de la force d’assistance de ~ 24 picoNewton (pN) à ~ 44 pN à saturation de l’ATP n’a provoqué aucun changement marqué dans la vitesse moyenne de translocation de NSP13. En outre, il a suggéré que la translocation NSP13 était principalement un mouvement induit par l’hydrolyse de l’ATP.
Les auteurs ont également noté que les étapes de déroulement du duplex d’ADNds (en moyenne) étaient près de huit fois plus longues que celles de la translocation d’ADNss. De plus, le déroulement du dsDNA était plus lent que la translocation du ssDNA, bien que leurs temps de séjour soient corrélés. Un effet similaire a été observé dans une autre étude examinant l’hélicase SF1A PcrA à l’aide de SPRNT. Curieusement, l’ARN polymérase ARN-dépendante du SRAS-CoV-2 (RdRp) et NSP13 forment un complexe à ∼170 nt/s à 37 °C, similaire à ce qui a été observé comme vitesse de déroulement NSP13 à l’aide de SPRNT.
En outre, les auteurs ont noté que l’ATPγS interférait avec l’action de NSP13 via plusieurs processus cinétiques différents. Le mécanisme dominant, cependant, dépendait de l’application de la force d’assistance. Bien que l’ATPγS ne soit pas un candidat-médicament viable pour NSP13, il a démontré la puissance de SPRNT dans l’examen des mécanismes d’inhibition de l’hélicase. Il a identifié trois méthodes d’inhibition de NSP13 :
i) réduire sa processivité,
ii) empêcher ses domaines 1A et 2A de se joindre suite à la liaison des nucléotides, et
iii) ralentir davantage l’hydrolyse de l’ATPγS par rapport à l’ATP.
conclusion
Dans l’ensemble, l’étude a mis en évidence le SPRNT comme un outil précieux et puissant pour examiner le rôle de NSP13 dans le complexe de réplication et de transcription du SRAS-CoV-2 (RTC). La méthode SPRNT a également montré une capacité supérieure à faciliter l’étude de la cinétique de translocation NSP13 ou de toute hélicase, même sans duplex. De plus, les expériences SPRNT pourraient faciliter l’étude de NSP13 sur des séquences natives du SARS-CoV-2 pour faire la lumière sur des éléments de séquence spécifiques du génome SARS-CoV-2 hautement structuré et leur rôle dans la régulation de NSP13.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
