Dans cette interview, Chris Adams Ph.D., directeur du développement commercial, bioinformatique mondiale, spectrométrie de masse des sciences de la vie chez Bruker Daltonics, Billerica, MA, États-Unis, parle àMa CliniqueLife Sciences de l’acquisition d’une protéomique 4D en temps réel, précise et reproductible données avec PaSER.
Sommaire
Pourriez-vous commencer par donner à nos lecteurs une brève introduction à la plateforme PaSER ?
PaSER (Parallel Search Engine in Real-Time) est notre solution bioinformatique en temps réel. PaSER effectue une recherche dans la base de données en parallèle avec l’acquisition de données sur un spectromètre de masse timsTOF à grande vitesse. Il a été conçu pour offrir une expérience « run and done » complète et pour rationaliser les flux de travail en maximisant l’efficacité de la transformation des données en informations utilisables.
PaSER a été initialement lancé il y a un an et demi. Il s’agit essentiellement d’un boîtier indépendant compatible GPU qui se trouve à côté de votre PC d’acquisition. Il fonctionne sur une carte graphique Nvidia avec plus de 4 000 cœurs programmables, ce qui signifie qu’il est capable de rechercher des données à la vitesse d’acquisition, y compris les PTM. Les recherches hors ligne bénéficient également de la puissance du GPU.
Informations provenant du PC d’acquisition, telles que le temps de rétention, la mobilité des ions, le précurseur m/z et les spectres d’ions fragmentés, sont tous envoyés à PaSER et traités en temps réel. Les résultats de la recherche dans la base de données sont livrés dès que l’acquisition est terminée – c’est pourquoi nous l’appelons « run and done ».
Il est important de souligner que pour assurer une recherche en temps réel viable à une vitesse de balayage de 120 Hz, nous devons atteindre un temps de recherche par spectre inférieur à 8 ms.
La recherche par GPU est une idée originale de Robin Park, qui a développé un moyen de paralléliser le traitement sur un GPU. Au lieu de rechercher sur des dizaines de cœurs de processeur, vous effectuez en fait une recherche sur des milliers de cœurs de GPU.
Cela accélère considérablement la recherche, et nous pouvons le faire avec les PTM et dans certains paramètres de modification semi-tryptique, en fonction de la taille de la base de données.
Crédit d’image: Bruker Daltonics
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Comment fonctionne TMT Quant dans PaSER, et quels sont certains des avantages de l’utilisation de cette méthode ?
Lorsque Bruker a lancé son timsTOF Pro pour la première fois, il y avait un certain scepticisme quant à sa capacité à faire du TMT, mais vous pouvez faire du TMT avec cet instrument avec des avantages supplémentaires de vitesse de séquençage et une réduction des interférences.
Il existe certaines limitations autour de la résolution au niveau inférieur m/z niveaux mais vous pouvez faire TMT 9 ou 10-plex comme d’autres l’ont montré et vous pouvez rechercher cela sur la boîte PaSER en temps quasi réel.
Les paramètres de recherche généraux tels que les enzymes et les modifications statiques sont généralement définis avant l’acquisition des données, ce qui signifie qu’une identification en temps réel est possible. Les paramètres sont entièrement personnalisables et peuvent être définis pour n’importe quel ensemble d’ions rapporteurs utilisés.
Une fois la recherche dans la base de données terminée, l’utilisateur sélectionnera l’analyse quantitative, définira les options relatives aux ions rapporteurs utilisés et aux tolérances souhaitées, puis cliquera simplement sur « soumettre » pour obtenir les résultats.
En termes de précision et d’efficacité de quantification, cette approche est aussi bonne, sinon meilleure, que d’autres packages acceptés comme l’étalon-or.
Crédit d’image: Bruker Daltonics
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Quelle est la place de la nouvelle fonctionnalité TIMScore dans ce processus ?
TIMScore exploite la quatrième dimension – la capacité de prédire la section efficace de collision (CCS) à l’aide d’un modèle d’apprentissage automatique. Nous avons travaillé en étroite collaboration avec un étudiant diplômé talentueux nommé Ty Garrett du laboratoire du professeur John Yates, qui a mis au point un modèle capable de prédire avec précision et de manière reproductible les sections efficaces de collision.
Nous pouvons utiliser ces sections efficaces de collision prédites et les référencer par rapport à la section efficace de collision déterminée expérimentalement, en calculant dans quelle mesure le CCS prédit correspond au CCS déterminé expérimentalement.
Là où cette fonctionnalité devient critique, c’est lorsque nous devons faire l’analyse discriminante, en choisissant des coups réels parmi des leurres. Lorsque nous incorporons cette dimension supplémentaire – TIMScore – nous pouvons regarder les données du point de vue d’un cuboïde de données. Cela signifie qu’au lieu de couper une ligne, nous pouvons utiliser un ajustement de courbure pour identifier toutes les caractéristiques que nous n’étions pas en mesure de trouver auparavant.
En pratique, cela permet à TIMScore d’augmenter considérablement le nombre de peptides, de protéines et de PSM identifiés tout en maintenant le niveau de confiance de 1 % FDR.
Crédit d’image: Bruker Daltonics
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Des études ont-elles été réalisées pour explorer le potentiel de TIMScore dans des applications réelles ? Pouvez-vous donner des exemples, si oui?
Nous avons testé le TIMScore en interne en prenant des publications du laboratoire de Yasushi Ishihama à l’Université de Kyoto qui examinaient les peptides trypsiques et phosphorylés et en comparant les résultats avec et sans TIMScore.
Nous avons déterminé qu’en utilisant le TIMScore, nous étions effectivement en mesure de doubler le nombre de peptides identifiés dans les rapports précédents.
Là où cela devient critique, c’est dans la couverture accrue des séquences protéiques. Au lieu d’observer 5,5 ou 7,5 peptides par protéine, nous observons maintenant 15 peptides par protéine.
Cette augmentation de la couverture des séquences est importante car nous ne découvrons pas ces nouvelles protéines au hasard – nous approfondissons et élargissons la couverture des séquences de protéines dont nous savions qu’elles existaient, mais nous n’avions tout simplement pas la capacité de les détecter formellement.
Nous avons constaté que le TIMScore fonctionne exceptionnellement bien au niveau des phosphopeptides. Ceci est important car normalement, lorsque nous fragmentons un phosphopeptide, nous obtenons une perte neutre et une faible série de peptides b et y, ce qui rend difficile la détection en toute confiance des algorithmes de recherche dans les bases de données.
La section transversale collisionnelle, ou 4D-Proteomics, aide à détecter les peptides que nous n’étions pas en mesure d’attribuer au départ.
Le Dr Stan Stevens a travaillé avec nous sur cet exemple d’application, et nous avons déjà constaté une bonne augmentation du nombre de phosphopeptides observables dans ses ensembles de données.
Crédit d’image: Bruker Daltonics
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Qu’est-ce que TIMS DIA-NN et comment cet outil peut-il être utilisé en laboratoire ?
Avec un moyen puissant d’effectuer des recherches dans la base de données à l’aide de la boîte PaSER et avec le TIMScore généré en temps réel, nous avons voulu répondre à un autre besoin quantitatif.
L’adoption de la technologie timsTOF a été forte, et notamment nous avons vu plus de chercheurs utiliser une approche dia-PASEF, puis utiliser des algorithmes comme DIA-NN, Spectronaut ou MaxDIA pour effectuer l’analyse. L’algorithme DIA-NN a été développé par les Drs. Vadim Demichev et Markus Ralser et a vraiment profité à la communauté protéomique.
Nous avons réorganisé et intégré avec succès DIA-NN dans un algorithme spécifique au fournisseur et compatible CCS dans la boîte PaSER sous la forme de la nouvelle fonctionnalité TIMS DIA-NN.
Les nouvelles bibliothèques sont plus grandes en raison de la dimension CCS supplémentaire et de TIMScore qui permettent une meilleure identification. En fait, Robin Park et son équipe ont ajouté 20 fonctionnalités supplémentaires au TIMS DIA-NN pour tenir compte de cette dimension supplémentaire.
TIMS DIA-ANN est en mesure de fournir une quantification sans étiquette et une correspondance entre les séries (MBR) sur une grande cohorte d’échantillons.
Pour voir comment cela fonctionne dans un environnement de laboratoire typique, nous pouvons utiliser un exemple du nombre de groupes de protéines identifiés à partir de 200 ng de lysat K562. Plus de 8 300 protéines ont été identifiées à l’aide d’une colonne PepSep 25 avec nanoElute sur un timsTOF Pro 2 et une bibliothèque spectrale alimentée par TIMScore à l’aide de TIMS DIA-NN. Cela a été fait en seulement un court gradient de 35 minutes.
Crédit d’image: Bruker Daltonics
Crédit d’image: Bruker Daltonics
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Bruker Daltonics, le leader des solutions de spectrométrie de masse Expliquer TIMS dans la technologie timsTOF
Y a-t-il autre chose que vous aimeriez que nos lecteurs sachent ?
Je dois d’abord mentionner la compatibilité du PaSER. PaSER fonctionne avec le timsTOF, le timsTOF Pro 2, le timsTOF SCP et le timsTOF FLEX – toute la série timsTOF est applicable.
Nous avons également obtenu d’excellents résultats en travaillant avec l’équipe de cellenOne vers la protéomique unicellulaire, où nous avons utilisé un timsTOF SCP et un TIMS DIA-NN pour trier différents nombres de cellules et différents types de cellules.
Même en travaillant au niveau de la cellule unique avec une véritable quantification sans étiquette dans la protéomique unicellulaire et sans canal de rappel, le nombre de précurseurs et de groupes de protéines identifiés est tout à fait remarquable.
Nous savons que les cellules HeLa sont environ six fois plus grandes que les cellules HEC 293, et dans cette expérience, les chercheurs ont remarqué que l’hétérogénéité des types de cellules commence à devenir plus évidente à mesure que ces différentes populations cellulaires sont regroupées.
Tous les exemples que j’ai partagés montrent les capacités exceptionnelles de PaSER avec la technologie timsTOF. PaSER offre une véritable expérience utilisateur « run and done », même lorsque vous travaillez avec TMT et au niveau d’une seule cellule.
Tirer parti de ses fonctionnalités puissantes étend encore ses capacités, avec TIMScore permettant une quatrième dimension qui fournit plus d’ID PSM, de peptides et de protéines et TIMS DIA-NN prouvant un nouveau flux de travail dia-PASEF qui est entièrement intégré dans la boîte PaSER.
À propos de Bruker Daltonics
Découvrez de nouvelles façons d’appliquer la spectrométrie de masse aux défis analytiques les plus urgents d’aujourd’hui. Des innovations telles que la mobilité des ions piégés (TIMS), les faisceaux intelligents et les lasers à balayage pour l’imagerie MALDI-MS qui offrent une véritable fidélité des pixels, et la technologie eXtreme Resolution FTMS (XR) capable de révéler les signatures de la structure fine isotopique (IFS) poussent l’exploration scientifique vers de nouveaux sommets . Les solutions de spectrométrie de masse de Bruker permettent aux scientifiques de faire des découvertes révolutionnaires et d’approfondir leurs connaissances.
