Dans une étude récente publiée dans Communications naturellesles chercheurs ont proposé une approche simplifiée pour analyser les vaccins à base d’acide ribonucléique messager (ARNm) à l’aide d’un séquençage à lecture longue.
Sommaire
Arrière-plan
Les vaccins à ARN messager ont démontré leur sécurité et leur efficacité pendant la pandémie de COVID-19, mais des tests approfondis de qualité et de pureté sont nécessaires pour vérifier leur efficacité et leur sécurité. Les progrès de la fabrication ont permis de fabriquer des milliards de doses avec une qualité et une sécurité acceptables.
Diverses approches sont désormais utilisées pour évaluer les vaccins à ARNm ; cependant, l’efficacité des nouvelles thérapies dépend d’une fabrication rapide et sûre. Des analyses rigoureuses sont nécessaires à chaque étape du processus de production pour détecter les impuretés et garantir la sécurité des vaccins à ARNm.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont étudié la méthode VAX-seq pour l’analyse de la qualité des vaccins à ARN messager.
Les chercheurs ont développé VAX-seq, une procédure simplifiée pour analyser les vaccins et les produits thérapeutiques à ARNm à l’aide du séquençage à lecture longue. Cette procédure compare VAX-seq aux normes de l’industrie, notamment la chromatographie, l’électrophorèse capillaire et sur agarose et l’immunotransfert. Les chercheurs ont utilisé diverses méthodologies, notamment le séquençage de l’ADN plasmidique Illumina, le séquençage ONT cDNA-PCR et le séquençage direct de l’acide ribonucléique Oxford Nanopore.
Les principales caractéristiques de qualité de l’ARN messager évaluées par VAX-seq étaient la similarité des séquences, l’intégrité, la dimension de la queue du nucléotide 3′-poly(A) et la contamination par l’ARN et l’ADN. Pour aider VAX-seq, une boîte à outils logicielle a été créée qui fournit des rapports complets et automatisés sur la qualité de l’ARNm. Un ARN messager amélioré de la protéine fluorescente verte (eGFP) a été créé et généré comme référence pour démontrer l’application et la validité de la méthodologie,
La matrice plasmidique a été amplifiée dans Escherichia coli, isolée, purifiée et linéarisée comme étape initiale du processus de préparation. La matrice d’ADNp linéarisée a ensuite été utilisée comme matrice pour la transcription synthétique de l’ARNm. in vitro. Pour examiner l’ARNm isolé, le programme a été combiné avec un séquençage d’acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc). VAX-seq a attaché une amorce de transcriptase inverse à l’extrémité 3′ de la queue du nucléotide poly(A), permettant de mesurer la longueur de la queue.
Les chercheurs ont utilisé le tailfindr programme pour normaliser les erreurs de suppression et le taux de translocation des nucléotides spécifiques à la lecture. Dans le cadre du processus VAX-seq, la préparation complémentaire de la bibliothèque d’ADN a introduit deux adaptateurs de type flanquant aux extrémités 5′ et 3′ de l’ARN messager.
Pour identifier les molécules d’ARNm de longueur complète à partir de l’ARN messager tronqué, les lectures de séquençage contenaient les deux adaptateurs flanquants. Les contaminants d’ARN hors cible ont été identifiés à l’aide de VAX-seq, qui a été utilisé pour évaluer les contaminants d’ARN fragmentés et hors cible dans les bibliothèques d’ADNc.
Résultats
L’analyse a révélé que VAX-seq, une technique de séquençage des vaccins à ARNm, peut détecter la séquence, la longueur, l’intégrité et la pureté. Il a également permis l’examen de modèles d’ADN plasmidique linéarisé et la détection d’impuretés issues de l’amplification plasmidique. VAX-seq a facilement établi la longueur et la similarité des séquences du vaccin à ARNm. Le profil de taille de l’ARNm de l’eGFP a révélé un pic majeur (77 %) qui se situait à moins de 5,0 % de la longueur prévue. [1,153 nucleotide (nt)-long], ainsi qu’un spectre varié d’ARNm plus petits et fragmentés. Le séquençage à lecture courte a fourni une couverture insuffisante et incohérente, tandis que la couverture d’alignement hétérogène était hautement reproductible entre les répétitions.
La plupart des séquences étaient alignées sur le produit ARN messager ciblé, et seules quelques lectures ont été révélées. Escherichia coli contamination. Les sept pour cent restants des espèces d’acide ribonucléique étaient des molécules d’ARN hors cible, dont 0,3 % provenaient vraisemblablement de sites d’initiation de la transcription cryptique. Les bibliothèques de séquençage direct d’acide ribonucléique produisent des rendements inférieurs à ceux des bibliothèques génétiques de séquençage d’ADN complémentaires comparables et ne peuvent pas être multiplexées pour le moment.
Les chercheurs ont cependant identifié des biais particuliers au séquençage direct de l’acide ribonucléique, tels que la suppression de la queue des nucléotides poly(A) de qualité inférieure. Le séquençage direct de l’acide ribonucléique a révélé des nucléosides modifiés dans les vaccins à ARN messager, démontrant que l’inclusion de nucléosides modifiés dans les vaccins à ARNm pourrait diminuer la réponse immunologique innée tout en améliorant la stabilité et la traduction.
Les nucléosides modifiés avaient un effet minimal sur les caractéristiques de qualité de l’ARN messager et sur les erreurs de séquençage d’ADN complémentaire entre les ARN messagers, y compris la N1-méthylpseudouridine native et l’uridine, mais le séquençage direct de l’acide ribonucléique présentait un taux d’erreur plus important.
L’ADN complémentaire et le séquençage direct de l’acide ribonucléique ont révélé que les vaccins à ARN messager modifié avaient des transcrits de type plus tronqué, avec 41 % de molécules d’ARN messager de longueur complète et 54 % de molécules d’ARN messager tronquées, en particulier celles de moins de 500 nt de longueur. Le séquençage direct de l’acide ribonucléique a découvert des nucléosides de N1-méthylpseudouridine avec une erreur d’appel de base distinctive qui a mal catégorisé la N1-méthylpseudouridine en cytosines, faussant le profil de longueur de l’ARN messager.
Conclusions
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que VAX-seq était une procédure basée sur le séquençage de longues lectures qui évaluait les caractéristiques essentielles de la qualité de l’ARNm telles que l’intégrité, la contamination et l’identité de la séquence. Cette technique peut potentiellement devenir importante pour le développement et la production de médicaments à ARNm, offrant une évaluation approfondie et intégrée à différentes étapes de fabrication. VAX-seq a utilisé le séquençage d’ADN complémentaire complet en utilisant la chimie Nanopore, ce qui a permis une évaluation précise de la longueur de la queue moléculaire poly(A) ainsi que diverses lectures hors cible.
L’approche offrait une évaluation sensible et quantitative des caractéristiques de l’ARNm, ce qui en faisait une alternative plus efficace aux techniques analytiques conventionnelles. VAX-seq a permis l’identification en temps réel de l’intégrité de l’ARN antisens et de l’ARN messager, permettant ainsi des tests rapides durant quelques heures après la fabrication.
Il pourrait également identifier des contaminants complexes d’acide ribonucléique hors cible créés lors de la transcription. in vitro, ainsi que la dégradation ou le partage des vaccins à ARN messager pendant la fabrication, le stockage et le transport. VAX-seq ne nécessitait qu’une petite quantité d’ARN messager comme entrée et peut être intégré pour permettre une validation à grande échelle et à faible coût des lots de vaccination.