La pandémie de coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) a mis en évidence les lacunes des interventions d’urgence à l’échelle mondiale et a entraîné une demande massive de technologies de test de diagnostic in vitro.
La technologie quantitative de réaction en chaîne par polymérase en temps réel (qPCR) est largement utilisée comme test de diagnostic pour la détection du SRAS-CoV-2, mais elle ne répond pas de manière optimale aux besoins de diagnostic à grande échelle de cette pandémie mondiale sans précédent. Les longs délais d’exécution, la complexité, les pénuries de la chaîne d’approvisionnement et le coût élevé sont certains des inconvénients de RT-qPCR qui réduisent son efficacité et entravent l’accès aux tests.
De nombreux pays s’adaptent et développent des technologies moléculaires pour surmonter ces lacunes. La technologie d’amplification isotherme à médiation par boucle de transcription inverse (RT-LAMP) est l’une d’entre elles et peut être une alternative viable à la technologie qPCR pour répondre aux besoins de diagnostic de la pandémie COVID-19.
Sommaire
La technique RT-LAMP et son principe
LAMP est une technique de détection qui fonctionne sur le même principe d’amplification d’acide nucléique que la PCR. Cependant, LAMP est une technologie isotherme et ne nécessite pas de thermocycleurs, qui coûtent plusieurs milliers de dollars. Par conséquent, RT-LAMP utilise un équipement minimal par rapport au RT-qPCR et constitue une meilleure alternative aux méthodes de test actuellement utilisées.
Le test LAMP nécessite au moins 4 (et jusqu’à 6) amorces différentes, dont 2 contiennent une région auto-complémentaire qui produit une boucle simple brin perpétuelle et 2 ciblent la région dans la structure de boucle simple brin. Ainsi, LAMP peut produire des quantités détectables d’ADN presque en même temps que la PCR, mais à une seule température de réaction. La détection d’ADN peut être réalisée via différentes méthodes telles que la turbidité ou en utilisant un colorant fluorescent.
Les efforts de détection antérieurs se sont concentrés sur l’utilisation de la détection colorimétrique des produits d’amplification à l’aide d’un colorant pH ou d’un indicateur de magnésium. Les changements de couleur produits par ces colorants, bien qu’adéquats, ont un contraste visible limité et peuvent souvent être ambigus.
LAMPEShade Violet offre une meilleure clarté visuelle et limite l’ambiguïté
Afin de résoudre les problèmes ci-dessus, des chercheurs américains ont récemment utilisé le nouveau colorant pH LAMPShade Violet (LSV) dans RT-LAMP. Le LSV a un meilleur contraste visuel entre un pH élevé et bas et un point d’inflexion plus fort, qui permettent tous deux une interprétation facile des résultats et réduisent l’ambiguïté. Leur étude a été publiée sur le serveur de pré-impression, medRxiv*.
Pour la détection du SRAS-CoV-2, les chercheurs ont utilisé la salive comme échantillon respiratoire au lieu d’écouvillons nasopharyngés. L’échantillonnage de la salive est beaucoup plus facile que le prélèvement d’écouvillons nasopharyngés. Des études antérieures ont confirmé la compatibilité de la salive avec les tests RT-LAMP même en l’absence de purification de l’ARN. L’équipe a ajouté une étape d’inactivation qui normalise le pH, inactive les RNases et libère de l’ARN. Cependant, comme la salive est hétérogène chez différents individus, une stratégie d’inactivation universelle n’est pas possible.
Nos résultats d’optimisation de la purification suggèrent également plusieurs directions inexplorées pour les futurs diagnostics d’acide nucléique à base de salive. »
Ainsi, ils ont optimisé un protocole d’inactivation avec un meilleur succès sur des échantillons de salive hétérogènes combinés avec LAMPShade Violet. Ils ont développé un protocole de purification d’ARN de 10 minutes à partir de la salive et l’ont nommé protocole de billes magnétiques SalivaBeads. Ils ont également développé un bâton magnétique (MS), StickLAMP, qui offre une purification fiable de l’ARN à base de billes et un accès simple et économique aux tests à partir d’échantillons de salive.
« MS présente également plusieurs avantages par rapport à l’autre méthode traditionnelle de séparation des billes, la purification par support magnétique. »
Plusieurs caractéristiques de la purification SalivaBeads. (a) Une comparaison de l’uniformité de la couleur de l’échantillon avant l’incubation dans 12 échantillons, avec les réactions du SRAS-CoV-2 et de l’actine côte à côte. L’entrée directe de salive inactivée dans une réaction commerciale à base de rouge de phénol est comparée à une entrée d’ARN purifié par SalivaBeads dans notre réaction à base de violet LAMPShade. (b) Une comparaison de l’ARN du SRAS-CoV-2 récupéré à partir d’échantillons de salive artificiels par N1 qPCR, mesurée par le nombre de copies récupérées par qPCR divisé par le nombre de copies fabriquées dans la salive. (c) Une comparaison visuelle des débris liés aux billes magnétiques lors de l’isolement des billes par support magnétique (à gauche) ou un bâton magnétique (à droite). (d) Une comparaison de la sensibilité entre les SalivaBeads purifiées via un support magnétique (à gauche) et un bâton magnétique (à droite), par RT-LAMP avec LAMPShade Violet.
Protocoles à faible coût idéaux pour les zones à faibles ressources qui luttent pour contenir la propagation du SRAS-CoV-2
Selon les auteurs, les protocoles de détection du SRAS-CoV-2 qu’ils ont développés sont rentables, à moins de 5 $ / test sans tenir compte de la main-d’œuvre et de la mise en commun des échantillons, et ils offrent une meilleure évolutivité par rapport aux protocoles existants sans affecter la sensibilité des tests. . Les auteurs ont ajouté que les nouveaux protocoles sont idéaux pour les écoles ou les lieux de travail avec un petit nombre d’étudiants ou d’employés compris entre moins de 10 et quelques milliers. Le faible coût des nouveaux protocoles les rend adaptés aux environnements à faibles ressources et mal desservis qui ont été touchés de manière disproportionnée par la pandémie de SRAS-CoV-2.
Les exigences minimales en équipement et leur faible coût les rendent également bien adaptés aux environnements à faibles ressources, qui pourraient encore être en mesure de monter un laboratoire CLIA de complexité moyenne. »
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / le comportement lié à la santé ou être traités comme des informations établies.
