Étude: Evolution dirigée de particules de type virus conçues avec une efficacité de production et de transduction améliorée. Crédit d'image : Griffes de dragon/Shutterstock.com
Une étude récente publiée dans la revue Biotechnologie naturelle discute du développement d'un nouveau système pour l'évolution dirigée de particules ressemblant à des virus (eVLP) avec des capacités de transduction et de production améliorées.
Que sont les eVLP ?
La capacité d’administrer efficacement et en toute sécurité des macromolécules dans les cellules in vitro et in vivo est crucial pour diverses modalités de traitement émergentes. Bien que les vecteurs de virus adéno-associés (AAV) puissent délivrer avec succès des agents d'édition de gènes in vivoils sont associés à plusieurs limitations.
Par conséquent, des méthodes de livraison supplémentaires sont nécessaires pour surmonter ces limitations. Les VLP comprennent des échafaudages viraux qui emballent et délivrent des acides ribonucléiques messagers (ARNm), des protéines ou des ribonucléoprotéines (RNP). Les VLP offrent une transduction efficace, des tropismes tissulaires, une édition hors cible réduite et une expression de cargaison transitoire.
Auparavant, les auteurs de la présente étude ont développé des eVLP qui permettent une édition efficace des gènes et une administration efficace des protéines. in vitro et in vivo. Au sein de ces systèmes, les protéines cargo sont fusionnées aux protéines rétrovirales Gag dans les eVLP, qui dirigent la localisation du cargo dans les particules virales au fur et à mesure de leur formation. Le lieur cargo-Gag contient une séquence qui doit être clivée par une protéase rétrovirale après la formation des particules, qui libère ensuite la cargaison à l'intérieur des particules et dans les cellules transduites.
Résultats de l'étude
Les chercheurs ont développé un système d’évolution dirigée en laboratoire pour les eVLP. Initialement, l’identité des variantes d’eVLP a été élucidée à l’aide d’ARN à guide unique (sgRNA) codés pour permettre la sélection des variantes souhaitées avec des propriétés spécifiques. La compatibilité des sgRNA codés avec la production fonctionnelle d’eVLP a ensuite été développée, après quoi une séquence de codes-barres de 15 paires de bases a été insérée dans la tétraboucle de l’échafaudage de sgRNA.
Des éditeurs de base (BE)-eVLP de quatrième génération (v4), qui emballent une cargaison RNP d'adénine BE (ABE) active, ont été utilisés pour les expériences de validation. Les BE-eVLP standard v4 ont été produits en co-transfectant quatre plasmides dans des cellules productrices, qui codaient pour la fusion Gag-ABE, la polyprotéine Gag-Pro-Pol du virus de la leucémie murine Moloney (MMLV), la protéine d'enveloppe G du virus de la stomatite vésiculaire et l'ARNsg dirigé vers -édition de la base cible.
Par la suite, des eVLP v4 contenant des sgRNA tétraloop ou à code-barres canonique avec quatre codes-barres arbitrairement sélectionnés ont été produits et comparés en mesurant leur efficacité d'édition de base. Il a été constaté que les eVLP à code-barres présentaient une puissance comparable aux eVLP standard, tandis que les eVLP avec des sgRNA à code-barres distincts avaient des puissances comparables. De plus, les eVLP dépourvus de la fusion Gag-ABE contenaient 216 fois moins de sgARN que les eVLP canoniques v4.
Des expériences supplémentaires ont indiqué que les sgARN codés à barres pourraient être utilisés pour étiqueter des variantes distinctes d'eVLP et que les codes à barres enrichis après sélection identifient les variantes présentant une forme physique améliorée.
Ce système d’évolution a ensuite été appliqué pour muter et sélectionner des capsides présentant des fonctionnalités améliorées. À cette fin, une bibliothèque de capsides eVLP à code-barres contenant 3 762 mutants à résidu unique de domaines de capside et de nucléocapside de la protéine Gag du MMLV dans la cargaison Gag-ABE a été générée.
Cette bibliothèque de codes-barres a été utilisée pour construire une bibliothèque de cellules productrices d’eVLP avec code-barres. La transduction lentivirale des cellules productrices, suivie de l'expansion des cellules transduites, a amplifié la fraction de cellules productrices avec une seule paire de variantes code-barres-capside.
La bibliothèque de capsides eVLP à code-barres a été soumise à deux sélections pour une production améliorée à partir de cellules productrices et une transduction de cellules HEK293T, respectivement. À cette fin, la production d’eVLP a été initiée à partir de la bibliothèque de cellules productrices à code-barres, la bibliothèque résultante de variantes de capside étant purifiée.
Par la suite, les sgRNA emballés dans l’eVLP ont été isolés et les codes-barres présents après cette sélection de production ont été séquencés. L'enrichissement de la production d'eVLP a été estimé pour chaque séquence de codes-barres, ce qui a permis d'identifier les codes-barres présentant un enrichissement accru par rapport à ceux des capsides canoniques d'eVLP. Environ 8 % des mutants de capside de la bibliothèque présentaient un enrichissement en production plus élevé que la capside canonique eVLP.
Les cellules HEK293T ont été incubées avec la bibliothèque de capsides eVLP à code-barres purifiée. Après six heures, les sgARN transduits dans les cellules cibles ont été isolés et l’enrichissement de la transduction eVLP a été calculé pour chaque séquence de codes-barres.
Seulement 0,7% de tous les mutants de capside présentaient un enrichissement moyen en transduction supérieur à celui de la capside canonique v4 eVLP. Bien que la plupart des mutants de capside aient eu des efficacités de transduction et de production pires que la capside canonique v4 eVLP, aucun mutant n'a présenté d'améliorations dans leur production ou transduction, suggérant ainsi que des mécanismes distincts et concurrents dictent leur efficacité.
Plusieurs mutants ont été sélectionnés pour des analyses plus approfondies basées sur des enrichissements positifs en matière de production ou de sélection de transduction. Les mutants qui améliorent une propriété sans altérer l’autre ont été prioritaires.
L’introduction de mutations de capside dans la construction Gag-ABE n’a pas augmenté la puissance. Cela a conduit les chercheurs à évaluer la puissance des mutants de capside dans la construction Gag-ABE avec une mutation Q226P, qui était enrichie de la manière la plus robuste lors de la sélection de production dans la construction Gag-Pro-Pol (GagQ226P-Pro-Pol).
Divers mutants de capside ont augmenté la puissance de délivrance du BE jusqu'à trois fois par rapport aux eVLP v4. Cinq mutations, dont C507V, C507F, A505W, D502Q et R501I, avaient la puissance la plus élevée ; cependant, une combinaison mutante, GagC507V-ABE avec GagQ226P-Pro-Pol, avait une puissance 3,7 fois améliorée et a été désignée comme BE-eVLP de cinquième génération (v5).
Les puissances des BE-eVLP v4 et v5 ont été comparées, ce qui a indiqué que les BE-eVLP v5 avaient des efficacités d'édition de base significativement plus élevées et étaient plus puissantes que les BE-eVLP v4. Il est intéressant de noter que l’efficacité d’édition maximale obtenue avec les BE-eVLP v4 a été atteinte avec une dose 16 fois inférieure de BE-eVLP v5.
Conclusions
Les chercheurs de la présente étude ont développé un système d’évolution dirigée pour les eVLP dotés de propriétés souhaitées et ont utilisé ce système pour muter/sélectionner des mutants de capside eVLP dotés de propriétés améliorées. De plus, des eVLP v5 avec un emballage et une libération de cargaison améliorés, des particules de plus grande taille et une puissance de livraison plus élevée que les eVLP v4 ont été développés. Dans l’ensemble, cette méthode d’évolution de l’eVLP avec code-barres pourrait soutenir le développement de futurs véhicules de livraison qui surmontent les limitations associées aux systèmes actuels d’édition de gènes.
