Un nouveau rapport, publié sur le serveur de préimpression bioRxiv* par des chercheurs de l'Institut Fraunhofer de biologie moléculaire et d'écologie appliquée, décrit le développement d'un test sérologique innovant qui pourrait fournir une méthode rapide, facile et peu coûteuse de détection de titres élevés d'anticorps dans le sérum de personnes infectées par le SRAS-CoV-2 .
Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) est responsable de la pandémie actuelle de COVID-19, qui a touché plus de 6,59 millions de personnes dans le monde et causé près de 400 000 décès en un peu plus de cinq mois. On pense que l'infection asymptomatique est extrêmement courante avec ce virus, ce qui rend les mesures de confinement extrêmement difficiles.
Sommaire
Pourquoi les tests sérologiques?
L'identification des individus infectés avant qu'ils ne deviennent symptomatiques, si c'est le cas, est donc de la plus haute importance pour les mesures de santé publique. Un autre avantage énorme est la capacité d'identifier ceux qui sont immunisés, ce qui pourrait faciliter l'application d'un verrouillage sélectif dans de nombreuses régions tout en permettant la reprise de l'activité économique, sans mettre en danger indûment la santé publique.
Troisièmement, l'identification précise des personnes infectées peut aider à comprendre le potentiel réel de la maladie, les facteurs de risque et les caractéristiques de transmission du virus. Enfin, les tests sérologiques seront utiles pour déterminer la force et la durabilité de l'immunité naturelle. Pour tous ces tests, il est essentiel de développer des méthodes rapides, peu coûteuses et facilement applicables qui peuvent être utilisées sur le site des soins. À l'heure actuelle, il en existe peu.
Dosages actuels et leurs limites
Un système de test au point de service actuellement utilisé est le test d'écoulement latéral, qui offre des tests rapides et faciles sur site mais n'est pas suffisamment sensible ou spécifique, en plus de ne pas pouvoir mesurer les concentrations d'anticorps. Celles-ci sont donc inférieures aux formats de tests en laboratoire qui utilisent un dosage immuno-enzymatique (ELISA).
Actuellement, le maillon faible des tests sérologiques désormais disponibles est l'antigène de test utilisé. L'antigène le plus puissant est la glycoprotéine spike (S), qui est ciblée par les anticorps neutralisants et est essentielle pour l'entrée du virus dans la cellule hôte. L'antigène nucléocapside (N) est également immunogène mais réagit de manière croisée avec des anticorps dirigés contre d'autres coronavirus.
La sous-unité S1 de la protéine S est généralement recommandée pour la détection spécifique d'une réponse immunitaire au SRAS-CoV-2. Des tests appropriés, selon les critères ci-dessus, utilisant cet antigène, ne sont pas actuellement disponibles.
La procédure MInD
L'utilisation de l'immunodétection magnétique (MInD) pourrait résoudre ce problème. Il s'agit d'une procédure basée sur l'immunofiltration, où une matrice recouverte d'antigène est utilisée pour piéger des anticorps spécifiques dans l'échantillon appliqué à la matrice par écoulement gravitaire. Ces anticorps sont ensuite détectés à l'aide d'anticorps secondaires.
Enfin, des nanoparticules magnétiques (MNP) spécialement conçues sont ajoutées pour étiqueter les anticorps secondaires, les anticorps non liés sont lavés et la lecture magnétique est ensuite obtenue avec un appareil portable qui utilise la technologie de détection de mélange magnétique en fréquence (FMMD).
Configuration du test MInD de validation de principe à l'aide d'IFC revêtu d'antigène SARS-CoV-2. Les étapes et la durée du test sont indiquées. Les IFC ont été enrobées de peptide commercial de la protéine S du SARS-CoV-2 et bloquées avec de la BSA. L'anticorps correspondant a été dilué dans du PBS ou enrichi de sérum humain et appliqué aux IFC. Des anticorps secondaires biotinylés ont été ajoutés, suivis de l'application de MNP fonctionnalisé à la streptavidine. Enfin, des IFC ont été insérés dans le dispositif de lecture magnétique portable. Le signal de mesure peut être corrélé à la quantité d'anticorps dans l'échantillon et le titre d'anticorps peut être déterminé. Le temps d'analyse de cette configuration préliminaire MInD était de 42 min, ce qui est environ quatre fois plus rapide que ELISA (161 min).
Comment l'étude a été réalisée
Le présent article rapporte une étude de preuve de concept de l'utilisation du MInD par rapport à l'ELISA standard, dans laquelle le premier est beaucoup plus efficace pour détecter spécifiquement les anticorps anti-SARS-CoV-2 dans le sérum humain.
Les chercheurs ont utilisé un peptide dérivé de la protéine S du SARS-CoV-2 pour enrober les colonnes d'immunofiltration. Ensuite, des anticorps réactifs à ce peptide ont été introduits à des concentrations variables dans les colonnes et rincés à travers eux. Les anticorps spécifiques se sont liés à l'antigène enrobé et ont ainsi été enrichis dans la matrice de la colonne.
Ils ont ensuite été marqués à l'aide d'un anticorps biotinylé spécifique à l'isotype. Ensuite, des particules magnétiques superparamagnétiques fonctionnalisées à la streptavidine ont été appliquées et rincées à travers les colonnes pour marquer les anticorps secondaires. Après incubation, les MNP en excès ont été lavés et les MNP liés ont été détectés en utilisant le lecteur magnétique portable à base de FMMD.
Les signaux de mesure correspondent à la quantité d'anticorps lié dans l'échantillon analysé.
La comparaison de la nouvelle méthode avec l'ELISA en laboratoire, qui a été réalisée sur le même échantillon comme point de référence, a provoqué plusieurs observations.
Gain de temps
L'expérience a duré 161 minutes et peut détecter des anticorps anti-SARS-CoV-2 spécifiques dans une plage de 3,4 à 477 ng / mL. Ceci est extrêmement sensible en ce qui concerne les niveaux typiques d'IgG dans le sérum humain, à environ 10 mg / ml, et augmente lorsque l'individu est exposé à l'antigène.
Plage plus élevée, sensibilité plus large
Les kits de test disponibles dans le commerce pour les anticorps spécifiques anti-sous-unité S1 peuvent détecter les anticorps IgG dans les trois quarts des échantillons dans les 10 à 20 jours suivant l'infection. Des tests plus sensibles pourraient détecter des anticorps au début de l'infection.
Cependant, par rapport au test ELISA, le test MInD était capable de détecter des anticorps anti-SARS-CoV-2 dans une plage de 2,95 à 2040 ng / mL, ce qui est cinq fois plus large. Cela signifie que le test est beaucoup plus sensible que ELISA, avec une limite de détection inférieure et une gamme de détection plus large. Il permet également des mesures quantitatives en raison de la large plage dynamique.
La procédure n'a pris que 42 minutes, ce qui n'est que le quart du temps requis pour le test ELISA, ce qui montre son potentiel pour des tests rapides. Cela peut être encore réduit en optimisant les étapes sélectionnées, telles que la réduction du temps d'incubation à 5 minutes ou même moins et en utilisant des MNP auxquels des anticorps spécifiques à l'antigène sont déjà liés. Cela éliminerait le besoin d'incubation avec des anticorps secondaires.
Avec ces adaptations, la durée totale du test serait inférieure à 20 minutes, ce qui est comparable à celui d'un test à écoulement latéral.
Améliorations et implications futures
D'autres innovations importantes seraient l'utilisation d'antigènes dérivés de la sous-unité S1 de la protéine S, ou de multiples antigènes de la protéine SARS-CoV-2 dans un mélange. Les antigènes de contrôle d'autres coronavirus humains doivent être testés pour confirmer la spécificité des anticorps enrichis.
Les tests multiplex utilisant une gamme de MNP pourraient faciliter la détection de plusieurs sous-classes d'anticorps dans un seul essai. Cela pourrait être utile en ce qu'il démontre non seulement la séroconversion mais aussi la phase de l'infection et le cours de la formation d'anticorps.
Enfin, l'optimisation du lecteur magnétique en un instrument de diagnostic médical rendra le test adapté à de telles applications, telles que l'inclusion d'un lecteur de codes-barres et l'étiquetage des colonnes avec des codes-barres spécifiques au patient. Le coût de la procédure est d'environ un dixième ou moins d'un test ELISA typique, ce qui la rend idéale pour une utilisation dans les cabinets de médecins.
Le potentiel d'utilisation d'une seule pipette pour la procédure de dosage et le lecteur magnétique (peut-être alimenté par batterie) rendent le dispositif approprié pour diverses applications médicales. Par exemple, il pourrait être utilisé dans les maisons de soins infirmiers et de soins aux personnes âgées, ou dans les aéroports, pour des tests rapides et pratiques au point de service.
Une fois qu'un vaccin est disponible, la même méthode peut être utilisée pour surveiller l'émergence d'anticorps et leur durée. Ainsi, cette technique peut être utilisée de plusieurs manières et à différents moments, comme mesure de point de service rapide et pratique sans coût supplémentaire ni équipement sophistiqué.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
