Une étude publiée sur le bioRxiv* le serveur de préimpression a testé l’hypothèse selon laquelle le récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE-2) du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) n’est pas seulement un facteur d’attachement dans l’infection virale, mais joue également un rôle dans l’activation du protéine de pointe virale pour faciliter la fusion membranaire.
Sommaire
Arrière plan
Le virus SARS-CoV-2 infecte les cellules humaines à l’aide du récepteur hôte ACE-2. La protéine de pointe virale régit l’entrée du SRAS-CoV-2 et l’infection car elle se lie aux récepteurs ACE-2 à la surface de la cellule humaine. L’ACE-2 est activé par clivage protéolytique et entraîne la fusion entre la membrane cellulaire et l’enveloppe virale.
Des preuves circonstancielles d’études suggèrent que l’ACE-2 peut non seulement servir de facteur d’attachement, mais peut également aider à activer la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 pour la fusion membranaire. Une meilleure compréhension du rôle de l’ACE-2 dans la fusion membranaire peut aider à illustrer le mécanisme derrière l’infection par le SRAS-CoV-2 et à prédire l’évolution future du SRAS-CoV-2 et d’autres virus similaires.
L’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé des attaches d’acide désoxyribonucléique (ADN)-lipides car elles peuvent s’insérer dans les membranes de manière irréversible et permettre un auto-assemblage programmable.
En utilisant cette approche, des brins d’ADN complémentaires conjugués à des lipides peuvent être insérés dans des particules virales afin que des liposomes synthétiques puissent cibler la particule sans avoir besoin de récepteurs physiologiques. Les déclencheurs nécessaires à la fusion sont ensuite reconstitués chimiquement et testés. La fusion est détectée à l’aide de la microscopie optique à virus unique, où les changements d’état viral pendant la fusion sont surveillés à l’aide de colorants fluorescents. Les chercheurs ont déjà utilisé l’approche de fixation ADN-lipides pour caractériser l’entrée virale par diverses familles de virus, y compris les flavivirus et les orthomyxovirus.
Les chercheurs ont mesuré la liaison et la fusion dépendantes des pointes aux membranes synthétiques et cellulaires, à l’aide de liposomes synthétiques, pour garantir l’absence du récepteur ACE-2. Trois pointes SARS-CoV-2 – D614G/N501Y, Wuhan et Omicron (B.1.1.529) – et deux types de particules virales – des particules de type virus (VLP) produites en exprimant les protéines S, M, E et N et pseudovirus sur un noyau de VIH – ont été utilisés dans les expériences.
L’équipe a incubé séparément des membranes cibles et des particules virales avec des brins d’ADN complémentaires conjugués à des lipides DPPE. Ils ont immobilisé des membranes cibles dans une cellule d’écoulement microfluidique, permettant aux particules virales de se lier.
Résultats
Les événements de fusion se sont avérés se produire uniquement lorsque des particules virales étaient attachées aux membranes cibles et en présence de protéase. La fusion a été principalement surveillée à l’aide d’un mélange de lipides entre la membrane cible et la particule virale et détectée par la désactivation du colorant Texas Red dans l’enveloppe virale, ce qui a conduit à une amélioration de la fluorescence. La liaison virus-ACE-2 médiée par l’ADN était spécifique; le nombre de particules adsorbées a diminué de plus de 25 fois lorsque l’ADN a été omis. De même, il n’y a pas eu d’événements de fusion en l’absence de protéase exogène.
En comparant la cinétique de fusion virale des pointes d’Omicron et de Wuhan pseudotypées sur les cœurs du VIH et les VLP Wuhan D614G/N501Y utilisées dans cette étude, l’équipe a constaté que si les deux pseudovirus présentaient des taux de fusion similaires, les VLP produisaient des taux de fusion légèrement mais significativement plus rapides.
La différence observée dans les taux de fusion pourrait être due à une variété de facteurs, y compris les variations de densité de protéines de pointe sur les VLP par rapport au noyau du VIH, les protéines E et M dans les VLP, les mutations D614G/N501Y et le pourcentage de pointes actives sur les VLP. Surface VLP.
Lorsque la protéase utilisée pour l’activation variait dans les expériences Omicron et Wuhan, les taux de fusion n’étaient pas sensibles à la concentration de protéase dans la plage de 200 à 1000 µg/mL. En accord avec les rapports antérieurs, la protéase transmembranaire, la sérine 2 (TMPRSS2) n’était pas efficace pour activer les pointes Omicron pour la fusion membranaire. Cependant, dans le cas des particules D614G/N501Y, l’ajout de 40 µg/mL de TMPRSS2 a entraîné une cinétique de fusion différente de 200 µg/mL de trypsine.
Ces observations suggèrent que le clivage protéolytique n’est peut-être pas l’étape limitant la vitesse de fusion membranaire des VLP attachées à l’ADN, car la modification de la concentration de protéase devrait affecter la formation du complexe enzyme-substrat et les modifications de l’identité de la protéase devraient modifier la cinétique de fusion.
Lors de l’ajout simultané d’ACE-2 soluble à la protéase, une augmentation significative de la vitesse de la cinétique de mélange des lipides a été observée dans des expériences utilisant à la fois des pointes de Wuhan et d’Omicron. Cela montre que bien que les conformations de protéines de pointe nécessaires à la fusion membranaire soient accessibles sans ACE-2, le récepteur ACE-2 favorise les conformations de pointe qui favorisent la fusion membranaire.
Conclusion
Dans l’ensemble, les chercheurs ont observé que lors de l’activation à l’aide d’une protéase appropriée, les pseudovirus SARS-CoV-2, ainsi que les VLP, ne nécessitent pas d’ACE-2 pour la fusion membranaire. Cependant, l’ajout d’ACE-2 soluble a accéléré la réaction de fusion dans la souche SARS-CoV-2 Wuhan et la variante Omicron. Les résultats de l’analyse cinétique ont révélé un minimum de deux étapes limitantes pour la fusion de la membrane virale. L’une des étapes dépendait de l’ACE-2, tandis que l’autre ne l’était pas.
Les résultats ci-dessus confirment que le récepteur ACE-2 n’est pas nécessaire sur le plan biochimique pour la fusion membranaire du SRAS-CoV-2 si un facteur de fixation alternatif est présent. Étant donné que l’ACE-2 agit comme un facteur de haute affinité pour l’attachement viral sur les cellules humaines, son remplacement par d’autres facteurs d’attachement peut cependant affecter la capacité du SRAS-CoV-2 à évoluer et l’environnement de fitness viral pour les coronavirus émergents à l’avenir .
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
