Dans une étude récente publiée dans Virusles chercheurs ont présenté la méthode de transfection directe de plasmide pour la production de particules pseudo-virales (VLP) du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) dans des cellules d’insectes et ont appliqué les VLP pour évaluer l’efficacité des anticorps monoclonaux (mAbs) et du donneur vacciné sérums.
Sommaire
Arrière plan
Les restrictions de biosécurité limitent la recherche avec le virus SARS-CoV-2 authentique et, par conséquent, des systèmes de pseudovirus (PV) basés sur le lentivirus ou le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) sont utilisés. Cependant, les particules PV résultantes n’expriment qu’une seule des protéines structurelles du SRAS-CoV-2[enveloppe(E)pointe(S)membrane(M)etnucléocapside(N)Depluslaproductionphotovoltaïqueimpliquedesprocessuscomplexesetnécessitedeslaboratoiresdeniveaudebiosécurité2(BSL2)[envelope(E)spike(S)membrane(M)andnucleocapsid(N)InadditionPVproductioninvolvescomplexprocessesandrequiresbiosafetylevel2(BSL2)laboratories
Alternativement, des VLP peuvent être produits qui ressemblent à des virus authentiques, s’assemblent par eux-mêmes lors de la co-expression de la protéine SARS-CoV-2, et sont sûrs car ils manquent de données génomiques et, par conséquent, ne peuvent pas se répliquer. De plus, le VLPS peut être produit dans les laboratoires BSL1. Les VLP du SARS-CoV-2 sont généralement produites dans des systèmes cellulaires basés sur le BEVS (baculovirus expression vector system) qui offrent des rendements élevés de VLP et ont neutralisé le SARS-CoV-2 chez les hamsters syriens. Ainsi, les BEVS-VLP peuvent potentiellement être utilisés comme vaccins contre la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19).
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont produit des VLP SARS-CoV-2 à base de plasmide dans un système de cellules d’insectes et les ont utilisés pour un test cellulaire basé sur la protéine fluorescente verte (GFP) pour un dépistage simple et rapide de l’immunité sérologique induite par les mAb anti-S et sérums.
L’équipe a analysé différentes conceptions de vecteurs d’expression et les rapports optimaux de SARS-CoV-2 M pour les tests de liaison cellulaire basés sur GFP et a évalué leurs performances dans le test immuno-enzymatique SARS-CoV-2 S (ELISA). Par la suite, la qualité des VLP a été évaluée par microscopie électronique à transmission (TEM), microscopie à épifluorescence, microscopie confocale (CFM), Western blot et analyse de nano-suivi (NTA) pour évaluer la liaison de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) et la ressemblance avec le SRAS authentique. CoV-2. En outre, les mAb et les sérums d’individus allemands vaccinés ont été criblés à l’aide des tests d’inhibition VLP auto-développés pour évaluer leur potentiel d’inhibition.
Les séquences d’acide désoxyribonucléique (ADN) codant pour SARS-CoV-2 E-, M- et S de la souche SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 ont été insérées dans le vecteur pOpiE2 et exprimées de manière transitoire dans des cellules High Five. Le SARS-CoV-2 M a été fusionné au GFP. Pour l’expression transitoire dans les cellules Expi293F, la protéine ACE2 dépourvue du peptide signal (SP) a été insérée dans le vecteur pCSE2.5.
L’expression de TMPRSS2 a été obtenue en remplaçant la moitié du plasmide pCSE2.5-ACE2 par l’ADN de Corona2a1, et des expériences de transfection ont été réalisées, après quoi le surnageant contenant les VLP a été récolté. En outre, les VLP ont été soumises à une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE), à une coloration, à une fluorescence dans le gel et à des analyses d’immunotransfert.
Les VLP enrichis ont été analysés par des tests ELISA en sandwich effectués à l’aide de STE90-C11 comme anticorps de capture spécifique au SARS-CoV-2 S RBD et de fusions solubles ACE2-mFc pour la détection. Des rapports tels que 1:1:1, 1:1:4, 1:1:6 et 1:1:8 pour l’expression S:E:M et VLP-6M-Furine (VLP-6M sans Wuhan-Hu-1 S) ont été évalués. Des VLP concentrées ont été transfectées avec des cellules Expi293F exprimant ACE2, et une analyse par cytométrie en flux (FC) a été effectuée pour déterminer la quantité de VLP liée aux cellules Expi293F exprimant ACE2.
Résultats
Des ajustements simples du rapport plasmidique ont été utilisés pour co-exprimer le SARS-CoV-2 E, M et S qui ont été auto-assemblés en VLP. La fusion de la protéine M à la GFP a permis la quantification directe de l’inhibition de la liaison à l’ACE2 par des mAb ou des sérums d’individus vaccinés. Les anticorps secondaires n’étaient pas nécessaires pour la purification des VLP ou le marquage fluorescent pour l’analyse FC. La fusion des protéines SP et M a considérablement réduit le signal de liaison VLP dans les tests ELISA en sandwich, tandis que la fusion SP à la protéine E a amélioré la liaison.
Les vecteurs d’expression VLP codaient E et S précédés de SP, alors que l’expression M en manquait. Les analyses sandwich ELISA et FC n’ont pas montré de différences significatives dans la liaison VLP lorsque différents rapports S:E:M ont été utilisés, à l’exception d’une légère liaison pour VLP-6M-Furine. Pour les tests cellulaires effectués par la suite, l’équipe a choisi VLP-6M. L’analyse TEM a montré des structures de virus authentiques VLP et SARS-CoV-2 similaires. La quantité de S sur la surface des VLP était corrélée à celle du vecteur d’expression de S utilisé dans les expériences de transfection et a conduit à une aura de S typique pour les VLP-1M, 4M et 6M.
L’analyse NTA a montré un rendement de 1013 VLP par litre pour tous les VLP, avec un rendement inférieur (1012) pour VLP-6M-Furine. Le diamètre moyen des particules de VLP-6M était de 145 nm (VLP-6M), similaire à celui des CoV (100 à 200 nm). Les analyses Western blot et SDS-PAGE ont montré l’incorporation de M et S (mais pas E) dans les VLP. Les VLP ont été vus comme de minuscules points verts sur les surfaces des cellules de rein embryonnaire humain (HEK) ACE2-TMPRSS2 co-exprimant Expi293F avec autofluorescence.
Le nombre de VLP et l’intensité de la GFP étaient légèrement plus élevés pour VLP-6M que VLP-6M-Furine et variaient en fonction de l’expression de l’ACE2. Dans l’analyse FC, des différences significatives ont été observées entre les histogrammes VLP et GFP de VLP-6M, dans lesquels deux populations différentes ont été identifiées, l’une exprimait VLP-6M lié et ACE2, tandis que l’autre ne le faisait pas. En revanche, pour VLP-GM-Furine, un déplacement de population a été observé, indiquant une capacité de liaison inférieure, comme on le voit dans ELISA.
De plus, les expériences d’optimisation ont montré que les tests de liaison cellulaire pouvaient être effectués en une heure sans perte de signal significative et que les VLP pouvaient être stockées à -80 ° C. Les mAb STE90-C11, STE94-F12, STE94-B1-E12 et STE90-B2-D12 (à une concentration de 150 µg/mL) ont montré une inhibition réussie de la liaison VLP-ACE2 et les résultats du test VLP ont reflété ceux du SARS-CoV-2 authentique essais de neutralisation. Une inhibition significative de la liaison a été observée à une dilution de 1:10 de sérums de vaccinés triple BNT162b2.
Conclusion
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que la production de SARS-CoV-2 VLP à l’aide de l’approche de transfection directe par plasmide est une alternative plus simple, plus rapide et plus fiable à l’approche BEVS.
