Dans une étude récente publiée sur le bioRxiv* serveur de prétirage, les chercheurs discutent d’une méthode robuste pour recenser les mutations qui améliorent simultanément l’expression et stabilisent la conformation de préfusion de la glycoprotéine de la pointe (S) du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de syndrôme respiratoire aigu sévère.
Étude: Identification à haut débit des mutations stabilisatrices de la préfusion dans le pic SARS-CoV-2. Crédit d’image : sanjaya viraj bandara / Shutterstock.com
Sommaire
Arrière plan
La plupart des vaccins contre la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) nécessitent une protéine SARS-CoV-2 S stabilisée par préfusion comme immunogène pour une efficacité accrue contre ce virus. Les mutations K986P et V987P S, par exemple, stabilisent sa conformation pré-fusionnée.
Toutes les méthodes actuellement utilisées pour concevoir des immunogènes vaccinaux à base de S stabilisés par préfusion impliquent un travail expérimental fastidieux et reposent sur des informations structurelles. La détermination structurelle et l’expression, la purification et la caractérisation ultérieures de chaque mutation S sont laborieuses, ce qui entrave leur identification rapide.
Des études antérieures ont montré que plusieurs autres mutations pourraient également améliorer l’expression du SRAS-CoV-2 S. Par exemple, une construction S connue sous le nom d’HexaPro contenant les mutations F817P, A892P, A899P et A942P, en plus de K986P et V987P, s’est avérée prouver l’expression de S.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs décrivent une nouvelle approche à haut débit pour mesurer la fusogénicité d’un ensemble de mutations SARS-CoV-2 S en parallèle, qui pourraient toutes potentiellement stabiliser sa conformation de pré-fusion sans s’appuyer sur des informations structurelles.
Cette méthode combine un test de fusion basé sur la fluorescence, une technologie d’affichage de cellules de mammifères et un balayage mutationnel profond (DMS). De plus, il cible un réarrangement conformationnel dans le domaine S2 qui couvre la première répétition heptadique (HR1), qui comprend 912-984, et l’hélice centrale (CH) des résidus 985-1034.
Les chercheurs ont construit une bibliothèque DMS composée de mutations d’acides aminés des résidus 883 à 1034 de la protéine S liée à la membrane et l’ont utilisée pour coder et exprimer un mutant S dans une cellule HEK293T landing pad. Toutes les cellules exprimant S ont également exprimé mNeonGreen211 (mNG211) et ont été appelées cellules exprimant S.
Une lignée cellulaire stable qui exprime l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 (hACE2) et mNG21-10, appelée cellules exprimant hACE2, a également été développée.
L’expression de S lié à la membrane dans 122 cellules HEK293T du coussin d’atterrissage et la formation de syncytia fluorescentes vertes en raison de la fusion des deux types de cellules ont été confirmées par cytométrie en flux (FC). Le test de fusion a été optimisé pour maximiser la formation de syncytia fluorescent vert tout en minimisant le risque de colmatage du trieur de cellules.
Les scores de fusion et d’expression pour chacune des 2 736 mutations faux-sens, 152 mutations non-sens et 152 mutations silencieuses de la protéine S ont été obtenus. Alors qu’un score d’expression plus élevé indiquait une expression S plus élevée, un score de fusion plus élevé indiquait une plus grande fusogénicité de la protéine S. Les scores d’expression et de fusion ont été normalisés de sorte que le score moyen des mutations silencieuses et des mutations non-sens soit un et zéro, respectivement.
Trois et deux répliques biologiques ont été utilisées pour les tests d’expression et de fusion, respectivement. Un score de fusion ajusté qui représentait le résidu d’un modèle de régression linéaire du score de fusion sur le score d’expression a également été obtenu.
Enfin, les chercheurs ont combiné les mutations validées incompétentes en fusion K986P, V987P, D994Q 181 et Q1005R pour générer des mutants doubles, triples et quadruples de la protéine S liée à la membrane ou pleine longueur.
Résultats de l’étude
À l’exception de F817P, toutes les autres mutations dans HexaPro présentes dans la bibliothèque DMS ont été criblées. Les données DMS ont montré de manière cohérente que A899P avait une influence minimale sur l’expression de S, alors que A892P et A942P augmentaient nettement son expression.
Mesure de l’expression protéique et de la fusogénicité des mutations SARS-CoV-2 S à l’aide d’un balayage mutationnel profond. a, Schéma des tests d’expression et de fusion à haut débit pour les mutants S. b, analyse par cytométrie en flux de l’expression de la protéine S dans les cellules du coussin d’atterrissage HEK293T qui codent pour WT S ou la bibliothèque DMS. c, micrographies fluorescentes de cellules d’expression S en co-culture avec des cellules exprimant hACE2. Barre d’échelle : 100 μm. d, analyse par cytométrie en flux de l’activité de fusion de la co-culture de cellules exprimant hACE2 avec des cellules de coussinet d’atterrissage HEK293T qui codent pour WT S ou la bibliothèque DMS. Les composants du mNG2 fractionné sont indiqués lorsqu’ils sont présents.
Parmi les répliques biologiques, le coefficient de corrélation de Pearson des scores d’expression variait de 0,72 à 0,79, alors que celui des scores de fusion était de 0,61, confirmant ainsi la reproductibilité des expériences DMS.
La distribution des scores d’expression et de fusion des mutations silencieuses était significativement différente de celle des mutations non-sens, indiquant ainsi que les expériences DMS pouvaient distinguer les mutants avec différents niveaux d’expression et de fusogénicité.
Scores d’expression et de fusion de mutations individuelles dans la bibliothèque DMS. un, Le tracé du score de fusion par rapport au score d’expression pour chaque mutant est présenté. WT est indiqué en rose. Mutations utilisées dans HexaPro24 sont en jaune. Les mutations représentatives incompétentes pour la fusion identifiées dans cette étude sont en violet (non fusogéniques). Les mutations représentatives qui améliorent la fusogénicité S sont en rouge (fusogénique). Mutations trouvées dans les principales variantes du SRAS-CoV-2 (Tableau de données étendu 1) sont en sarcelle (variantes). Chaque point de données représente une mutation dans la bibliothèque DMS. Les points de données individuels sont dimensionnés en fonction de la fréquence moyenne des mutations correspondantes. b, Le tracé du score de fusion ajusté par rapport au score d’expression pour chaque mutant est présenté. Coefficient de corrélation de Pearson, rest montré dans un B. c, Les emplacements des mutations incompétentes pour la fusion sont indiqués par des sphères bleu clair. Les régions mutées dans la bibliothèque DMS sont colorées blé, vert et rose pour chaque monomère.
Le test de fusion a mesuré la fusogénicité au niveau cellulaire, plutôt qu’au niveau de la molécule unique. De plus, le score de fusion était positivement et systématiquement corrélé au score d’expression.
Les mutations avec un faible score de fusion ajusté et un score d’expression élevé comprenaient K986P et V987P, qui sont tous deux utilisés dans les vaccins COVID-19 actuels, démontrant ainsi que la méthode d’étude pouvait identifier les mutations stabilisatrices de la préfusion.
En plus de K986P et V987P, la méthode d’étude a identifié d’autres mutations dans HR1 et CH qui avaient des scores de fusion ajustés bas et d’expression élevés, dont T961F, D994E, D994Q et Q1005R. Notamment, D994E et D994Q se sont regroupés aux mêmes positions de résidus d’acides aminés et étaient chimiquement similaires.
Conformément aux données DMS, les effets de T961F, D994E, D994Q et Q1005R sur l’expression de S et la fusogénicité étaient comparables à ceux de K986P et V987P dans les expériences de validation.
Validation des mutations candidates stabilisatrices de la préfusion. ac, expression de mutations stabilisatrices de préfusion (a), de mutations améliorant la fusion (b) et de combinaisons de mutations candidates stabilisatrices de préfusion de S (c) par rapport à WT. Il convient de noter que les valeurs numériques du changement de pli dans l’intensité de fluorescence médiane (MFI) indiquent des changements de pli relatifs et non absolus dans les niveaux d’expression de surface de S. df, changement de pli dans l’activité de fusion des mutations candidates stabilisant la préfusion (d), améliorant la fusion mutations (e) et combinaisons de mutations candidates stabilisant la préfusion de S (f) par rapport à WT à 3 heures après le mélange avec des cellules exprimant hACE2. Les abréviations des mutations combinatoires sont les suivantes : 2P, K986P/V987P ; 2PQ, K986P/V987P/D994Q ; 2PR, K986P/V987P/Q1005R ; 2PQR, K986P/V987P/D994Q/Q1005R. Les changements de pli sont affichés sous forme de moyenne ± plage. Les données proviennent de n = 2 répétitions indépendantes. Les données sources sont disponibles.
Les multiples mutations HR1 et CH, y compris celles trouvées dans les variantes du SRAS-CoV-2, n’ont pas eu d’impact négatif sur l’expression ou la fusogénicité de la protéine S. HR1 et CH étaient associés à des degrés élevés de conservation évolutive parmi les bétacoronavirus.
La plupart des anticorps neutralisants du SRAS-CoV-2 ciblent la région du domaine de liaison au récepteur (RBD) de la protéine S ; par conséquent, HR1 et CH peuvent être sous une faible pression de sélection. Une autre explication de cette observation est que d’autres contraintes évolutives sur HR1 et CH pourraient être présentes in vivo.
Bien que supérieure à la protéine S de type sauvage, l’expression de surface des combinaisons de mutations S était comparable. Aucune de ces combinaisons de mutations S n’a fusionné avec des cellules exprimant hACE2.
La chromatographie d’exclusion de taille (SEC) de tous les mutants a révélé que la mutation Q1005R augmentait probablement la formation d’oligomères d’ordre supérieur de l’ectodomaine S soluble. Ainsi, des mutations spécifiques de S pourraient améliorer l’expression de S sous forme liée à la membrane mais pas sous forme d’ectodomaine soluble.
conclusion
Étant donné que la stabilisation de la préfusion de la protéine S est essentielle pour la conception de l’immunogène viral, les résultats de l’étude ont de profondes implications pour le développement du vaccin COVID-19. De plus, les résultats mettent en évidence que les contraintes évolutives de S2 sont pertinentes pour la dérive antigénique du SRAS-CoV-2 et la conception de vaccins universels contre le coronavirus.
Néanmoins, les futures études devraient continuer à étudier la relation entre l’expression de la protéine S, la fusogénicité et l’aptitude à la réplication du SRAS-CoV-2 afin de déterminer les processus biophysiques qui contribuent à l’évolution du SRAS-CoV-2.
Les mutations stabilisatrices de la préfusion des protéines du bétacoronavirus S ont été signalées pour la première fois en 2010, bien avant le début de la pandémie de COVID-19. Cela a contribué à accélérer le développement de vaccins COVID-19, en plus des progrès de la technologie des vaccins à acide ribonucléique messager.
La prochaine pandémie pourrait être due à un virus pour lequel on manque de ce type d’information. Ainsi, il est impératif de maximiser la vitesse de conception des immunogènes vaccinaux pour accélérer la technologie de développement de vaccins pour les virus encore émergents susceptibles de provoquer des pandémies.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.