Accélérer la découverte d'anticorps avec l'analyse monocellulaire de nouvelle génération

Pourquoi les anticorps thérapeutiques sont-ils traditionnellement produits in vivo lors de la découverte précoce d'un médicament?

Typiquement, in vivo les modèles sont utilisés car ils sont rentables et relativement rapides pour générer des anticorps candidats qui peuvent être testés. Introduite par Köhler et Milstein en 1975, la technique traditionnelle d'hybridome de souris commence par l'injection d'un antigène validé ou connu dans le modèle animal, par exemple des souris, ce qui provoque une réponse immunitaire qui génère de nouveaux anticorps. Ces nouveaux anticorps peuvent ensuite être récoltés et entièrement caractérisés en aval pour garantir qu'ils ont la fonction moléculaire et les propriétés souhaitées.

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Les progrès scientifiques et technologiques se sont encore améliorés in vivo études. Plus récemment, des souris humanisées ont été immunisées pour exprimer des immunoglobulines humaines, plutôt que les gènes d'anticorps de souris, ce qui améliore leur traduction en aval.

Pourquoi les scientifiques s'éloignent-ils de la production d'anticorps dans les modèles animaux?

Les modèles animaux continuent d'être répandus, principalement parce qu'ils ont fait leurs preuves dans l'industrie avec de bons résultats. Malgré les défis, la technologie de l'hybridome est une plate-forme bien établie et l'humanisation des modèles animaux a encore favorisé cette méthode. La plupart des thérapies approuvées par la FDA ont été produites à l'aide de plateformes humanisées.

Cependant, les modèles animaux entièrement rongeurs peuvent entraîner une immunogénicité spécifique des rongeurs et les protéines du modèle animal peuvent rester à un stade ultérieur. En fait, tous les anticorps produits dans des modèles animaux humanisés ne seront pas entièrement humains.

D'autres technologies, par exemple, l'affichage des phages offrent une alternative intéressante car elles ne nécessitent pas de modèles animaux, ont des délais plus courts et les chercheurs peuvent utiliser une bibliothèque d'anticorps entièrement humains. Ces bibliothèques peuvent être assez diverses et peuvent contenir différentes constructions en leur sein, par exemple, des anticorps à domaine unique. L'utilisation du séquençage de nouvelle génération (NGS) avec affichage des phages permet de caractériser les gènes d'immunoglobulines de grandes populations, ce qui représente mieux les anticorps humains naturels.

L'affichage des phages n'est pas sans inconvénients non plus; comme il s'agit d'un système procaryote plutôt que mammifère, il peut y avoir des problèmes d'affinité et d'autres propriétés de ce in vitro Plate-forme.

Quelles caractéristiques les scientifiques recherchent-ils lorsqu'ils analysent des populations entières de cellules B productrices d'anticorps?

Après avoir réussi à immuniser un animal, un organe lymphoïde, par exemple la rate, est prélevé. Ceci est traité et les cellules B sont isolées. Les cellules B qui produisent des anticorps spécifiques de l'antigène qui se lient à l'antigène cible doivent alors être séparées de celles qui se lient à d'autres antigènes.

Ensuite, la réactivité à l'antigène cible est testée pour garantir que les anticorps sélectionnés se lient spécifiquement à l'antigène (plutôt qu'à une gamme d'antigènes) et que cette affinité et sensibilité est supérieure au niveau requis. Une fois les cellules B uniques isolées, les scientifiques rechercheront les caractéristiques de liaison, la réactivité croisée et plus encore.

Quelles techniques sont couramment utilisées pour cribler les cellules B pour ces caractéristiques?

Les équipes de recherche utilisent généralement la cytométrie en flux pour cribler les cellules B directement ou plus souvent pour produire des hybridomes qui sont ensuite criblés.

La production d'une population d'hybridomes nécessite une réaction de fusion entre les cellules B et une cellule de myélome cancéreux. Cela permet aux cellules B de proliférer et de survivre indéfiniment en culture, ce qui est essentiel pour sauvegarder les cellules potentielles d'intérêt. Malheureusement, lors de la création d'hybridomes, toute la population de cellules B ne peut pas être fusionnée; par conséquent, seule une fraction de la population totale peut être examinée, entraînant ainsi la perte d'une grande partie du répertoire des cellules B.

Traditionnellement, la cytométrie en flux est favorisée en raison de son débit élevé, et les anticorps sécrétés par les cellules B peuvent potentiellement être criblés en utilisant la capture à froid, une technique utilisée pour manipuler la cellule pour empêcher la sécrétion complète des anticorps en les piégeant à la surface des cellules . Cependant, il s'agit d'une représentation plutôt que d'une mesure directe de la sécrétion d'anticorps.

D'autres méthodes de dépistage comprennent ELISA et Elispot, qui peuvent mesurer la sécrétion des cellules B. Bien que ces techniques doivent souvent être complétées manuellement, ce qui les rend fastidieuses et limitées au dépistage à petite échelle.

Ces techniques peuvent créer un environnement hostile pour les cellules de grande valeur. Comment cela affecte-t-il la viabilité cellulaire et donc la productivité?

Une équipe de recherche passe généralement plusieurs mois au cours de ce cycle de processus, à immuniser le modèle animal, à collecter des cellules et à créer des hybridomes ou à cribler directement les cellules B. La population de cellules cibles peut être aussi faible que 0,001% des ~ 40 millions de cellules d'origine dans l'organe prélevé. Une perte supplémentaire due à la diminution de la viabilité cellulaire et à la mort cellulaire due au traitement rigoureux de ces cellules peut gravement affecter la productivité.

Après avoir terminé ce cycle, les cellules cibles peuvent ne pas être trouvées car elles n'ont pas été fusionnées avec succès pendant le processus de fusion des hybridomes ou sont mortes pendant la culture en raison du traitement difficile. C'est un gros défi dans l'industrie.

Comment le système d'analyse monocellulaire que vous avez développé résout-il ces problèmes?

La Cyto-Mine^® Le système d'analyse à cellule unique peut surmonter de nombreux défis dans l'industrie. Tout d'abord, le besoin d'une technologie à haut débit mais douce qui permet l'interrogation approfondie des répertoires de cellules B entières et des populations d'hybridomes tout en préservant la viabilité cellulaire. Deuxièmement, le besoin d'analyses hautement sensibles et spécifiques pour trouver des cellules sécrétant des anticorps rares avec les caractéristiques d'anticorps souhaitées.

Cyto-Mine^® peut être utilisé dans le criblage de populations de cellules entières pour trouver cette cellule B rare ou cet hybridome qui sécrète l'anticorps spécifique de l'antigène. En fait, les chercheurs peuvent entrer des cellules B isolées directement dans la Cyto-Mine^®, ce qui réduit considérablement les délais du cycle de traitement et élimine la possibilité de perdre des cellules en culture. De plus, Cyto-Mine^® offre la flexibilité dans la conception des tests, dont il existe un grand besoin en raison de la nature variable des cibles et des produits biologiques.

Soutenu par la technologie brevetée de picodroplet de Sphere Fluidics, Cyto-Mine^® intègre le criblage sélectif de dizaines de millions de cellules individuelles dans des compartiments aqueux miniaturisés de picoliter appelés picodroplets.

Les picodroplets fournissent des chambres de micro-réaction individuelles où les protéines sécrétées s'accumulent et peuvent être analysées pour identifier des protéines précieuses (par exemple, des anticorps ayant une spécificité antigénique), pour trouver des cellules rares d'intérêt ou pour trouver des cellules hautement productives.

Les picodroplets eux-mêmes fournissent un environnement protecteur pour les cellules B fragiles, les protégeant des contraintes de cisaillement lorsque les picodroplets se déplacent à travers les canaux microfluidiques. Les cellules peuvent également être encapsulées dans leur milieu de culture préféré, il n'y a donc pas de transitions de culture nuisibles.

En combinant l'isolement des cellules B et l'identification des «hits spécifiques à l'antigène» dans un processus qui ne prend que 1-2 jours dans Cyto-Mine^®, vous réduisez considérablement le stress sur les cellules fragiles et accélérez les étapes de l'analyse en aval telles que les tests fonctionnels ou le séquençage.

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Comment la technologie détermine-t-elle la spécificité de l'antigène?

Les utilisateurs doivent savoir si l'anticorps est une IgG ou une IgM, avant de fabriquer des sondes de détection qui se lieront à la cible d'intérêt. Le format du test est basé sur une simple réaction FRET, et deux sondes de détection doivent être encapsulées dans la picodroplet avec les cellules. Un qui se lie à la région Fc de l'anticorps et un autre qui cible l'antigène sur cet anticorps. Les deux sondes sont conjuguées à un fluorophore, créant une paire de sondes de détection pouvant induire une réaction FRET.

Lorsque les sondes de détection sont à proximité, c'est à dire. s'ils se sont liés aux régions Fc et Fab de l'anticorps sécrété, ils induiront un décalage médié par FRET sur la fluorescence où l'excitation d'une sonde transférera de l'énergie à l'autre qui émettra un signal fluorescent. Cyto-Mine^® détecte un transfert d'énergie au sein de la picodroplet, et comme les sondes de détection sont personnalisées pour cibler uniquement l'antigène d'intérêt, il n'y aura pas de transfert d'énergie fluorescent si l'antigène d'intérêt n'est pas présent.

Cyto-Mine^® prend en charge une conception de test flexible, de sorte que le format du test peut être adapté pour le rendre spécifique à la cible.

L'automatisation était-elle importante pour vous lors du développement de ce système? Si oui, pourquoi?

Développé en pensant à la biopharmacie, la conception initiale de Cyto-Mine^® s'est appuyé sur les contributions des principales sociétés pharmaceutiques pour résoudre leurs défis les plus importants et l'automatisation était vitale pour y parvenir.

Le processus actuel est incroyablement long et fastidieux. Les nouvelles techniques doivent avoir un débit, une diversité et une flexibilité élevés du test. Plutôt que d’automatiser le pipetage, nous avons créé un système entièrement nouveau pour aborder la découverte d’anticorps.

La Cyto-Mine^® est également applicable au développement de lignées cellulaires, où il existe un besoin similaire d'automatiser des processus inefficaces, et Cyto-Mine^® a une capacité d'imagerie et de distribution unicellulaire, ce qui en fait un excellent ajustement.

Comment pensez-vous que le processus de découverte des anticorps évoluera au cours de la prochaine décennie? Quel impact cela aura-t-il sur l'industrie pharmaceutique et les thérapies disponibles pour les patients?

Il existe une demande incroyablement élevée de produits biothérapeutiques à base d'anticorps, et il est facile de voir à quel point ils sont couronnés de succès avec plus de 500 produits thérapeutiques à base d'anticorps qui commencent à faire l'objet d'essais cliniques. Cette demande est illustrée par l’un des 20 anticorps de la Antibody Society à surveiller en 2020, un anticorps contre le virus Ebola. La société produisant cet anticorps a pu arrêter les essais avant la fin, car il était si efficace par rapport à tout autre traitement.

Au cours de la prochaine décennie, le processus de découverte d'anticorps doit devenir plus rapide et, à mesure que de nouvelles technologies sont intégrées, il devrait devenir plus rapide. Cette optimisation raccourcira le délai de mise sur le marché et mettra les nouvelles thérapies entre les mains des patients plus rapidement.

Où nos lecteurs peuvent-ils trouver plus d'informations?

À propos de Zoe Nilsson, Ph.D.

Le Dr Zoe Nilsson est la responsable du marketing produit mondial de Sphere Fluidics. Zoe est titulaire d'un BSc, MPhil et PhD en neurosciences et biologie cellulaire de l'Université de St Andrews, Royaume-Uni. Zoe travaille en étroite collaboration avec l'équipe R&D pour développer de nouvelles fonctionnalités de Cyto-Mine^® et de nouveaux kits de réactifs pour aider les clients biopharmaceutiques à identifier et à isoler les cellules rares d'intérêt.

Zoe est une chef de produit expérimentée avec une expérience démontrée de travail dans l'industrie des biotechnologies. Avant de rejoindre Sphere Fluidics, Zoe a dirigé le développement de nouveaux types de cellules à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à utiliser dans la recherche fondamentale, la découverte de médicaments et les tests de toxicité de sécurité.