Une nouvelle étude intrigante présente une nouvelle approche de l’évaluation basée sur des biocapteurs de médicaments prometteurs qui pourraient inhiber le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) via sa protéase de type 3C (3CLpro), une protéase virale.
Sommaire
Contexte
La protéase de type 3C (3CLpro) du SRAS-CoV-2, l’agent à l’origine de la pandémie de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), peut être une approche précieuse pour développer de nouveaux antiviraux pour contrer le virus. Pour comprendre son importance, il est nécessaire de jeter un coup d’œil sur le virus lui-même.
Le génome viral code pour deux grandes polyprotéines qui subissent une autoprotéolyse pour donner naissance à un certain nombre de protéines virales structurelles et accessoires. Parmi celles-ci se trouvent 16 protéines non structurelles (nsps).
Le clivage des polyprotéines est médié par deux des nsp, nsp3 et nsp5. L’une des protéases impliquées dans cette étape est la protéase de type 3C, 3CLpro ou la protéase principale également appelée nsp5. Ainsi, l’inhibition de la nsp5 pourrait être une stratégie antivirale efficace.
En fait, deux inhibiteurs de 3CLpro sont en cours d’essais cliniques contre COVID-19.
La découverte de ces inhibiteurs se faisait auparavant par des dosages enzymatiques utilisant la forme purifiée de l’enzyme, suivies d’études sur l’effet de ces inhibiteurs sur la perméabilité cellulaire et les activités cellulaires sur les cellules en culture. Afin d’explorer l’activité du SRAS-CoV-2 dans les cellules, cependant, les laboratoires de niveau de biosécurité 3 (BSL-3) ou BSL-4 sont obligatoires, ce qui est une exigence exigeante.
Au lieu de cela, des biocapteurs peuvent être utilisés pour éviter le besoin de niveaux de biosécurité aussi élevés. Cela comprend un site de clivage 3CLpro inséré dans une protéine fluorescente verte (GFP) qui perd sa fluorescence à l’insertion et redevient fluorescente une fois que l’enzyme induit le clivage.
D’autres biocapteurs ont inclus un marqueur modifié par la luciférase, avec un site de clivage 3CLpro entre deux fragments de luciférase complémentaires, perdant sa luminescence par clivage enzymatique, pour être restauré avec inhibition de son activité. D’autres biocapteurs à base de GFP ont également été décrits.
Cependant, le niveau auquel ces biocapteurs sont exprimés affecte les lectures, dans une large mesure, ainsi que l’expression de l’enzyme elle-même. La transfection des biocapteurs doit être accompagnée dans de nombreux cas de celle du plasmide enzymatique également, ou l’enzyme doit être transfectée dans une cellule avec un niveau stable d’expression du biocapteur. Dans d’autres cas, la cellule est relativement moins sensible à l’inhibiteur enzymatique.
La présente étude, disponible sur le bioRxiv* serveur de préimpression, signale un ensemble de biocapteurs basés sur la détection de transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET). Ces tests cellulaires peuvent aider à identifier les inhibiteurs de 3CLpro.
Comment le biocapteur a-t-il été conçu ?
Le biocapteur, dans ce cas, appelé pBRET-1, a été fabriqué en utilisant les séquences de clivage SARS-CoV-2 3CLpro comme lieur entre une GFP2 et une molécule de luciférase de Renilla (RLuc8), les joignant aux extrémités N et C. , respectivement. Une fois que l’enzyme a produit un auto-clivage, le BRET a été interrompu, entraînant la perte de bioluminescence, qui a été restaurée par l’ajout d’inhibiteurs de 3CLpro.
Plusieurs autres biocapteurs ont également été testés.
Quelles ont été les conclusions ?
La présence de GC376, un inhibiteur de 3CLpro, a conduit à une augmentation dose-dépendante du rapport BRET-pBRET. Ils ont constaté qu’à mesure que la concentration d’inhibiteur augmentait, le 3CLpro était d’abord clivé à l’extrémité N-terminale, suivi d’un clivage à l’extrémité C-terminale, comme on pouvait s’y attendre d’après le schéma de maturation de l’enzyme.
L’efficacité de l’autoclivage dans pBRET-1 peut être modulée en modifiant la séquence de clivage liant GFP2 et 3CLpro et celle entre 3CLpro et RLuc8, ce qui pourrait à son tour augmenter sa sensibilité aux inhibiteurs de 3CLpro. C’était le plus sensible parmi les biocapteurs.
La concentration efficace demi-maximale (CE50) pour GC376 avec pBRET-10 était de 11,60 M, mais elle a diminué à 2,72 M avec pBRET-1. La CE50 avec le bocéprévir et le composé 13b était d’un ordre de grandeur inférieur à celle du GC376, mais le composé 11a avait une activité comparable.
Par rapport aux tests cellulaires, le GC376 et le Bocéprévir ont montré des valeurs EC50 équivalentes, mais avec les composés 11a 1 et 13b, elles étaient neuf fois inférieures à la valeur rapportée avec ce biocapteur.
Quelles sont les implications ?
Les chercheurs ont montré que leurs biocapteurs, qui avaient une activité d’auto-clivage basée sur le BRET, peuvent être utilisés dans les laboratoires BSL-2 dans des tests cellulaires pour identifier la découverte d’inhibiteurs 3CLpro. En particulier, pBRET-10 avait des performances comparables à celles des dosages cellulaires de l’activité antivirale.
Une exploration plus poussée du mécanisme d’action montre que l’activité enzymatique de ces biocapteurs imite le processus naturel d’activation de cette enzyme lors de la réplication virale.
En outre, ce processus peut être utilisé pour identifier des inhibiteurs ciblant les protéases de type 3C d’autres coronavirus, et peut être adapté pour cibler les protéases d’auto-clivage utilisées par d’autres virus tels que Zika et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH).
Dans l’ensemble, l’étude a produit des biocapteurs sensibles pour l’évaluation cellulaire des inhibiteurs de 3CLpro, qui peuvent être utilisés dans les laboratoires BSL-2, qui imite l’activation naturelle de l’enzyme in vivo. Des biocapteurs similaires peuvent également être développés pour identifier les inhibiteurs des protéases auto-clivantes d’autres virus.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.
