Un système CRISPR-Cas compact et efficace, nommé CasMINI, pourrait être largement utile pour les applications d’ingénierie cellulaire et de thérapie génique, car il est plus facile à administrer dans les cellules. Les résultats apparaissent dans une étude publiée le 3 septembre dans la revue Cellule moléculaire.
Il s’agit d’une étape cruciale pour les applications d’ingénierie du génome CRISPR. Le travail présente le plus petit CRISPR à ce jour, à notre connaissance, comme une technologie d’édition du génome. Si les gens pensent parfois à Cas9 comme des ciseaux moléculaires, nous avons ici créé un couteau suisse aux multiples fonctions. Ce n’est pas un grand, mais un miniature qui est très portable pour une utilisation facile. »
Stanley Qi, auteur principal de l’étude, Université de Stanford
Le développement des systèmes CRISPR-Cas pour les cellules humaines a révolutionné l’ingénierie du génome. Ces systèmes offrent des opportunités pour le développement de thérapies géniques pour une variété de maladies génétiques. Mais leurs grandes tailles limitent souvent la livraison dans les cellules et entravent ainsi les applications cliniques. Par exemple, le virus adéno-associé (AAV), un vecteur largement utilisé pour in vivo livraison, a une capacité d’emballage limitée de la charge utile (moins de 4,7 kb), et de nombreuses protéines de fusion Cas dépassent cette limite. En conséquence, il est nécessaire de concevoir des systèmes Cas compacts et hautement efficaces pour faciliter la prochaine génération d’applications d’ingénierie génomique.
Une solution potentielle est Cas12f, également connu sous le nom de Cas14. Comptant entre 400 et 700 acides aminés, la protéine fait moins de la moitié de la taille des systèmes CRISPR actuellement utilisés tels que Cas9 ou Cas12a. Mais jusqu’à présent, il n’était pas clair si cette protéine compacte pouvait être utilisée dans les cellules de mammifères. « Ces dernières années ont identifié des milliers de CRISPR, qui sont connus comme le système de défense immunitaire des bactéries », explique Qi. « Cependant, plus de 99,9% des CRISPR découverts ne peuvent pas fonctionner dans les cellules humaines, ce qui limite leur utilisation en tant que technologies d’édition du génome. »
Dans la nouvelle étude, Qi et son équipe ont appliqué l’ingénierie de l’ARN et des protéines au système Cas12f pour générer un système Cas miniature efficace pour l’ingénierie du génome des mammifères. Dérivée des archées, la protéine Cas12f naturelle et son ARN à guide unique n’ont montré aucune activité détectable dans les cellules de mammifères. En optimisant la conception de l’ARN à guide unique et en effectuant plusieurs cycles d’ingénierie et de criblage itératives des protéines, les chercheurs ont généré une classe de variantes Cas12f nommée CasMINI.
Les variantes de protéine Cas12f modifiées combinées à des ARN à guide unique modifiés ont présenté une activité efficace de régulation et d’édition de gènes. Les chercheurs ont démontré que CasMINI peut entraîner des niveaux élevés d’activation de gènes comparables à ceux associés à Cas12a et permet une édition de base et une édition de gènes robustes. De plus, il est hautement spécifique et ne produit pas d’effets hors cible détectables.
« Ici, nous transformons un CRISPR non fonctionnel dans les cellules de mammifères, via l’ingénierie rationnelle de l’ARN et l’ingénierie des protéines, en un CRISPR fonctionnel très efficace », a déclaré Qi. « D’autres efforts ont déjà été déployés pour améliorer les performances des CRISPR fonctionnels. Mais notre travail est le premier à en faire fonctionner un autre qui ne fonctionne pas. Cela met en évidence le pouvoir de la bio-ingénierie pour réaliser quelque chose que l’évolution n’a pas encore fait. »
La taille de la molécule CasMINI modifiée n’est que de 529 acides aminés. Cette petite taille le rend approprié pour un large éventail d’applications thérapeutiques. Par exemple, les protéines de fusion CasMINI sont bien adaptées à l’empaquetage d’AAV. De plus, l’ARNm CasMINI peut être facilement emballé dans des nanoparticules lipidiques ou d’autres modalités de livraison d’ARN, améliorant potentiellement son entrée dans les cellules. Sa petite taille et sa source d’agents pathogènes non humains pourraient le rendre moins susceptible de produire des réponses immunitaires que ne le seraient des charges utiles de protéines importantes.
Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour optimiser davantage l’efficacité de CasMINI pour l’édition de bases et l’édition de gènes et pour tester les performances du système in vivo avec différentes modalités de livraison. Les chercheurs prévoient de tester le système pour in vivo applications de thérapie génique.
« La disponibilité d’un CasMINI miniature permet de nouvelles applications, allant de in vitro applications telles que la conception de meilleurs lymphocytes tueurs de tumeurs ou la reprogrammation des cellules souches pour in vivo thérapie génique pour traiter les maladies génétiques des yeux, des muscles ou du foie », a déclaré Qi. « C’est sur notre liste de souhaits qu’elle deviendra une thérapie pour traiter les maladies génétiques, guérir le cancer et inverser la dégénérescence des organes. »
