Des chercheurs développent une nouvelle méthode pour cartographier la glycosylation des protéines de pointe du SRAS-CoV-2

Les chercheurs développent une méthode originale, simple et abordable pour la prise d’empreintes N-glycane basée sur le marquage et l’électrophorèse enzymatiques des glycanes fluorescents. Cette nouvelle méthode peut nous aider à comprendre les changements importants dans la glycosylation dans la protéine de pointe du coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère – quelque chose qui pourrait éclairer la recherche thérapeutique future.

Les progrès de la génomique, de la protéomique et de la spectrométrie de masse ont permis aux scientifiques d’identifier des glycanes spécifiques sur des protéines et leur association avec des maladies. Cependant, ces méthodes sont coûteuses, nécessitent des experts hautement qualifiés et ne sont pas facilement disponibles.

Les chercheurs Zhengliang L. Wu et James M. Ertelt ont libéré les N-glycanes présents sur une glycoprotéine et les ont étiquetés enzymatiquement en utilisant de l’acide sialique conjugué au fluorophore et du fucose, et les ont séparés par électrophorèse sur gel. L’empreinte digitale du glycane sur la protéine est identifiée à l’aide d’étalons de glycane et d’échelles de glycane qui sont exécutées le long du gel (pour reconnaître les identités des bandes individuelles). Cette nouvelle méthode permet un aperçu rapide du schéma de glycosylation de toute glycoprotéine.

Les glycanes sont des sucres importants sur les protéines qui jouent divers rôles dans l’immunité, tels que la modulation de l’activation des lymphocytes T, la localisation des leucocytes et l’immunogénicité des protéines. On pense qu’une aberration dans la voie de glycosylation provoque des troubles auto-immunes. La glycosylation est une modification post-traductionnelle courante se produisant sur la membrane et les protéines sécrétées. Cela augmente la stabilité et la solubilité de ces protéines.

Le SRAS-CoV-2, l’agent pathogène causal de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), pénètre dans les cellules hôtes humaines à l’aide de sa glycoprotéine à pointe membranaire (S). La protéine de pointe contient 22 séquons de N-glycane (motifs NXS / T, où X est n’importe quel acide aminé sauf la proline).

La glycosylation sur la protéine de pointe camoufle les épitopes immunogènes de la protéine, protégeant de la neutralisation des anticorps – permettant ainsi au virus d’échapper à la réponse immunitaire de l’hôte. Le développement du vaccin contre le SRAS-CoV-2 est axé sur les protéines qui déclenchent l’infection.

La protéine de pointe est la cible principale des vaccins et une composante essentielle des tests sérologiques. Par conséquent, il est important de comprendre la glycosylation de cette protéine, pour laquelle une nouvelle méthode est proposée.

Dans cette méthode, les glycanes sont d’abord libérés par l’enzyme peptidique N-glycosidase F (PNGase F), puis marqués par une sialyltransférase ou fucosyltransférase avec un acide sialique conjugué au fluorophore ou du fucose, et les O-glycanes sur une glycoprotéine sont marqués en premier. suivi d’une digestion à la trypsine, et enfin, les glycanes ou glycopeptides marqués libérés sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide sulfate de sodium dodécyl (SDS-PAGE).

Empreinte digitale des N-glycanes libérés à partir de diverses protéines SARS2 Spike avec ST6Gal1 (rouge) et FUT8 (vert). Les N-glycanes de diverses protéines de pointe recombinantes libérées par la PNGase F ont été marqués par ST6Gal1 et FUT8 avec (+) ou sans (-) prétraitement d’une neuraminidase (Neu). Les échantillons marqués ont été séparés sur du gel SDS à 17% et imagés avec une imagerie régulière des protéines (panneaux supérieurs) ou une imagerie fluorescente (panneaux du milieu et du bas dans différents contrastes). Les bandes en rouge sont des glycanes complexes ou hybrides marqués par ST6Gal1 (via l’incorporation d’acide sialique conjugué à Cy5). Les bandes en vert sont des oligo-mannose glycanes marqués par FUT8 (via l’incorporation d’AlexaFluor 555-conjugated Fucose). Pour le marquage FUT8, MGAT1 / UDP-GlcNAc ont également été inclus dans le mélange de marquage pour convertir les oligo-mannose glycanes en substrats pour FUT8. Glycanes marqués de la ribonucléase B, S’1[6]N1, S’1[6]G1 et S’1[6]G1f ont été exécutés comme références dans (A) et une échelle de glycane avec 10 glycanes standard marqués a été exécutée dans (B). RS, domaine RBD de la protéine SARS2 Spike exprimée dans les cellules Sf21; RC, domaine RBD de la protéine SARS2 Spike exprimée dans les cellules CHO; RH, domaine RBD de la protéine SARS2 Spike exprimée dans des cellules HEK293; SC, protéine SARS2 Spike entière exprimée dans des cellules CHO; S1H, protéine SARS2 S1 exprimée dans des cellules HEK293; SH, protéine SARS2 Spike exprimée dans les cellules HEK293.

Les chercheurs ont découvert que lorsqu’une liaison d’un monosaccharide spécifique est ajoutée, la mobilité du glycane change à un rythme relativement constant. Cela permet en outre aux chercheurs de déduire les identités des bandes marquées.

Pour cette étude d’empreintes digitales de glycane, les chercheurs ont criblé les enzymes de marquage et optimisé la concentration du substrat pour la réaction de marquage en utilisant des glycanes libérés par la protéine du domaine de liaison au récepteur de la protéine de pointe exprimée dans les cellules CHO en tant que substrats. Les données de cette étude suggèrent que la RBD exprimée dans les cellules HEK293 contient principalement des glycanes complexes.

Notre étude fournit des preuves pour soutenir que les cellules hôtes déterminent les types de glycanes attachés aux protéines de pointe de SARS2, ce qui implique en outre que le schéma de glycosylation de la protéine de pointe de SARS2 chez les patients COVID-19 pourrait également être différent. ”Zhengliang L Wu et James M Ertelt

Dans cette étude, ils montrent également que les glycanes des protéines de pointe exprimées dans les cellules d’insectes et les cellules HEK293 sont complètement différents.

Parmi les diverses sialyltransférases, ils ont trouvé que ST6Gal1 et ST3Gal6 donnaient des signaux plus forts. Dans leur étude d’empreintes digitales N-Glycan des protéines de pointe du SRAS-CoV-2 avec ST6Gal1, ils ont trouvé l’existence de glycanes sialylés et asialylés sur ces protéines. Lorsque le même ensemble d’échantillons de protéines de pointe du SRAS-CoV-2 a été sondé avec ST3Gal6, ils ont observé des empreintes digitales de glycane similaires mais distinctives. Le marquage ST3Gal6 a également révélé des bandes uniques.

En tant que méthode de prise d’empreintes digitales, la structure globale des glycanes plutôt que les espèces individuelles de glycanes est au centre des préoccupations », disent les chercheurs dans leur article.

Même si la stratégie ne permet pas une analyse structurelle détaillée des glycanes spécifiques au site, ils discutent des avantages: simple, abordable, pratique, visuellement informatif, facile à interpréter, possibilité de multi-échantillonnage, efficace et quantitatif.

La technique couramment utilisée pour l’analyse des glycanes est la spectroscopie de masse. En mettant l’accent sur les avantages de la nouvelle méthode, les chercheurs élaborent sur les divergences trouvées dans les données de spectroscopie de masse sur les glycanes générés par différents laboratoires. Pour le matériau de référence des anticorps monoclonaux NIST 8671, analysé par 66 laboratoires à travers le monde, le nombre de compositions de glycanes identifiées par chaque laboratoire varie de 4 à 48!

De même, l’analyse par spectrométrie de masse de la protéine de pointe a révélé qu’elle était fortement modifiée avec des N-glycanes complexes, hybrides et oligomannoses. Cependant, les profils de glycane rapportés par d’autres variaient considérablement. La méthode proposée ici fournit une alternative pour la recherche et l’analyse des glycanes.

L’analyse des glycanes est essentielle pour que les chercheurs comprennent mieux les fonctions biologiques de la glycosylation sur des glycoprotéines individuelles. Les changements de glycosylation sont souvent une caractéristique des états pathologiques. Nouvelles stratégies thérapeutiques et diagnostiques basées sur la glycobiologie sous-jacente.

Les deux chercheurs de Bio-techne, R&D Systems, États-Unis, ont abordé une méthodologie importante en glycobiologie qui pourrait accélérer la science.

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