Dans cette interview avec Ma Clinique Life Sciences, le professeur Kristina Kusche-Vihrog, chef de l'Institut de physiologie de l'Université de Lübeck, parle de la nanomécanique des cellules vivantes et de leurs implications pour les maladies cardiovasculaires.
Sommaire
Pourriez-vous commencer par introduire nos lecteurs à vos recherches sur les cellules endothéliales et quel rôle ces cellules jouent?
J'ai commencé un projet de recherche en tant que postdoc, en examinant le rôle des cellules épithéliales. Au fur et à mesure que ces travaux se sont développés, nous avons reconnu que les cellules endothéliales qui bordent l'intérieur des vaisseaux sanguins ont également un impact considérable sur le système vasculaire. Ces cellules portent beaucoup de canaux ioniques dans leurs membranes plasmiques et sont très flexibles, ce qui signifie qu'ils peuvent réagir à la force du sang en streaming.
Leur position à l'intérieur du vaisseau sanguin est importante car les cellules endothéliales peuvent sentir tout ce qui vient avec le sang, leur permettant de réagir en conséquence. Par exemple, les cellules endothéliales pourraient ressentir des facteurs vasoactifs et fournir des signaux aux cellules musculaires lisses vasculaires qui les entourent.
Ces cellules peuvent également être déformées par des forces exercées par le sang en ruissellement. Lorsqu'ils sont déformés, ils réagissent d'une certaine manière, entraînant des facteurs vasodilatants ou vasoconstricteurs qui aident à réguler le système vasculaire.
Nous avons reconnu que ce comportement cellulaire est particulièrement important en termes de physiologie passive. Parce qu'ils sont flexibles et déformables, les cellules endothéliales peuvent basculer entre différents états mécaniques. Ils présentent généralement un comportement normal et sain, mais lorsque quelque chose se produit dans le corps, comme la maladie ou l'inflammation, les cellules modifient leur comportement et leurs propriétés mécaniques. Ceci est connu sous le nom de dysfonctionnement endothélial.
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Quel impact la rigidité des cellules et les propriétés mécaniques des cellules ont-elles sur le corps? Comment mesurer ces caractéristiques?
Une enzyme appelée eNOS (endothélial nitrique oxyde synthase) se trouve sous la membrane plasmique. Cette enzyme a été découverte il y a de nombreuses années. Lorsque les cellules sont douces et déformables, leur cytosquelette est dépolymérisé.
Le sang en streaming peut activer cette enzyme, provoquant une cascade d'arginine et d'autres substances. NO est produit par les cellules endothéliales en réponse à cette déformation de la circulation sanguine, provoquant une augmentation du diamètre des vaisseaux et, à son tour, une diminution de la pression artérielle.
Ce mécanisme important est connecté à la surface de la cellule, qui est de 150 à 200 nanomètres de la couche de cellule externe. Le glycocalyx est situé sur le dessus de la membrane plasmique; La couche sous la membrane plasmique est appelée cytosquelette cortical.
Quel rôle le glycocalyx joue-t-il dans les cellules endothéliales et la rigidité cellulaire? Comment est-ce généralement mesuré?
Le glycocalyx est une structure fascinante, et l'un des facteurs les plus importants de la fonction endothéliale est l'intégrité du glycocalyx.
Un AFM est l'instrument parfait pour mesurer le glycocalyx. Nous pouvons utiliser l'AFM pour mesurer cela en touchant le glycocalyx avec une petite pointe sphérique de 1 micromètre et avec une force de charge très faible dans la plage de 0,5 nanonewtons.
La structure des glycocalyx est très flexible et vulnérable, nous ne pouvons donc pas utiliser de forces de chargement élevé. Les premiers nanomètres de la cellule en retrait constituent le glycocalyx; Au fur et à mesure que nous inventons davantage, nous touchons la surface de la cellule endothéliale, de la membrane plasmique et du cytosquelette cortical sous-jacent.
La courbe AFM résultante comprend plusieurs pentes et peut prendre des semaines à analyser. Nous avons pu utiliser des enzymes comme l'héparinase pour éliminer le glycocalyx enzymatiquement, nous permettant de quantifier la hauteur et les propriétés mécaniques du glycocalyx et les propriétés mécaniques du cortex cellulaire.
Le glycocalyx a une structure de type maillage construite sur de nombreux facteurs de glycoprotéines et de protéoglycanes. Par exemple, le sulfate d'héparane est un composé important du glycocalyx. Le glycocalyx construit une structure protectrice vasculaire au-dessus des cellules. La quantification de cela peut être difficile, mais l'AFM est parfaitement adapté à cette tâche.
Conversations sur l'AFM # 3: Perfectiones d'un scientifique, nanomécanique dans les cellules vivantes
Crédit vidéo: Bruker BioAFM
Vos expériences sont-elles effectuées dans la culture cellulaire et avec quels types de cellules travaillez-vous normalement?
Nous utilisons plusieurs modèles différents. Les HUVEC sont notre étalon-or, et nous les isolons fraîchement les isolons de la veine ombilicale ici, après avoir approché des cellules de l'hôpital de l'Université de Lübeck.
Ces cellules posent un défi lorsqu'ils sont transfectés; Par exemple, nous pouvons utiliser CRISPR-CAS pour éliminer les canaux spécifiques dans la cellule.
Je préfère travailler ex vivoen utilisant des vaisseaux sanguins de souris ou de patients et de les diviser ouverts pour que les cellules endothéliales soient face vers le haut. Cela nous permet de mesurer ces cellules endothéliales en ex vivo vaisseaux sanguins. Ceci est idéal car nous pouvons utiliser des vaisseaux patients ou différents modèles de souris, y compris les cellules de souris transgéniques.
La préparation des glycocalyx prend du temps lors de la culture des cellules endothéliales. Ceci est souvent un problème dans d'autres laboratoires qui cultivent leurs cellules endothéliales pendant seulement deux jours, par exemple, car ce n'est pas suffisamment long pour une bonne préparation au glycocalyx.
Cellules en culture et ex vivo Les patchs de préparation ont besoin de temps, au moins trois à quatre fois jusqu'à ce que le glycocalyx soit récupéré et peut être mesuré.
L'hypertension artérielle est probablement la maladie vasculaire la plus connue, avec environ 50% des adultes qui ont une hypertension, selon le CDC. L'hypertension provoque une augmentation de la raideur cellulaire dans les vaisseaux sanguins, ce qui peut entraîner une inflammation et des problèmes secondaires. Comment voyez-vous votre travail se traduire directement en recherche médicale, par exemple, avec l'hypertension?
La rigidité endothéliale peut être directement corrélée à la rigidité artérielle. Nous avons déterminé cela via un projet où nous avons travaillé avec différentes cohortes de patients. Pour mesurer cela, nous avons utilisé des HUVEC standardisés et incubés avec du sérum patient, y compris des composés pathologiques.
Nous avons constaté que les facteurs dans le sérum du patient ont gravement endommagé le glycocalyx et raidies le cortex cellulaire. Ce cortex à cellules rigides pourrait être corrélée à la rigidité artérielle mesurée sous forme de vitesse d'onde d'impulsion.
Nos résultats au niveau unique étaient également vrais pour des parties importantes du système artériel. Nous avons trouvé une vasoconstriction locale, par exemple, mais dans le cas d'une maladie inflammatoire, je suis convaincu que le comportement des cellules endothéliales a un impact sur le système artériel.
Pourriez-vous également partager un aperçu de vos recherches sur la sclérose systémique et la rigidité des cellules et les composants mondiaux qui, selon vous, jouent un rôle dans ceux-ci?
Ce travail est un projet en cours, et nous avons actuellement des données préliminaires, en particulier sur les auto-anticorps comme celles associées à SARS-COV – 2.
Les maladies inflammatoires se traduisent par le corps produisant plus d'auto-anticorps, bien que ce processus puisse être une «boîte noire». Ces auto-anticorps se lient, par exemple, les récepteurs couplés aux protéines G comme les récepteurs de l'angiotensine II, changeant complètement la surface endothéliale.
Dans le cadre de ce processus, le glycocalyx est endommagé, avec sa hauteur complètement aplatie. Il s'agit essentiellement d'une perte du glycocalyx et d'un cortex plus rigide. Notre hypothèse de travail est que dans les maladies inflammatoires comme la sclérose systémique, nous voyons l'auto-réaction du corps, et lorsque ces auto-anticorps se lient à ces récepteurs, nous voyons des cascades spécifiques conduisant à des processus inflammatoires.
Ces récepteurs sont tous liés au cytosquelette cortical. Il s'agit d'un cytosquelette spécifique sous la membrane plasmique. Ce n'est pas les fibres de stress à l'intérieur de la cellule; Il s'agit plutôt d'un compartiment très étroit à environ 200 nanomètres du haut de la surface cellulaire. Ce maillage d'actine-myosine présente des protéines et des récepteurs de liens, avec le glycocalyx lié à l'actine via le syndecan ou le perlécan.
Les maladies inflammatoires conduisent à la perte du glycocalyx ou au raidissement cortical, provoqué par la polymérisation de l'actine corticale et un signal intrinsèque, qui conduit à l'effondrement du glycocalyx.
Nous pouvons manipuler le cytosquelette d'actine pour étudier cela, en utilisant la microscopie à fluorescence pour se concentrer sur le cytosquelette cortical. Mes recherches sont axées sur cette actine corticale, donc un microscope confocal est utile.
La manipulation du cytosquelette cortical implique d'utiliser du jasplakinolide pour polymériser le maillage d'actine, ou nous pouvons utiliser la cytochalasine D pour le dépolymériser. La manipulation des fibres d'actine sous la membrane plasmique entraîne des réactions du glycocalyx, avec un cortex rigide conduisant à un effondrement du glycocalyx et un cortex doux donnant un glycocalyx droit et approprié.
Quels sont les défis actuels de ce type de recherche?
Mes premières mesures AFM utilisant les premiers instruments ont été difficiles, mais les AFM modernes sont beaucoup plus conviviaux. Le vrai défi consiste à travailler avec ces types de cellules. Il est impératif que nous gérons les cellules de manière physiologique car ce sont des cellules vivantes, et seule une cellule vivante dans un environnement parfait peut correctement agir comme une cellule vivante.
Par exemple, des facteurs tels que le pH et la teneur en sel doivent être optimaux, avec un temps de croissance approprié dans tous les cas. Il est important d'étudier la morphologie et le comportement des cellules endothéliales avant l'expérience. Une grande expérience de travail avec des expériences de culture cellulaire est nécessaire pour confirmer que les cellules sont en bonne forme avant d'expérimenter.
Où pensez-vous que l'avenir de l'AFM mènera et quel rôle jouera-t-il pour les scientifiques à l'avenir?
L'AFM est l'une des meilleures méthodes pour quantifier la mécanique des cellules de manière fiable. Il me permet de voir en ligne comment une cellule vivante réagit lorsque j'applique des substances. Je voudrais voir des mesures plus standardisées, ce qui signifie que nous pouvons utiliser l'AFM comme outil de diagnostic.
Par exemple, les patients atteints d'une maladie rénale chronique nécessitent souvent des biopsies dans le rein, qui sont douloureuses. D'après les recherches de mon groupe, je sais que lorsque nous utilisons du sérum patient et incubez des HUVEC standardisés avec cela, nous pouvons faire la différence entre la troisième, quatre et cinq maladies rénales chroniques.
En utilisant le sérum du patient, nous pouvons voir des différences significatives de rigidité corticale et de hauteur de glycocalyx. Cette méthode est non invasive, et bien qu'il prenne du temps pour créer les courbes de force nécessaires, il serait utile d'intégrer l'AFM en tant qu'outil de diagnostic dans les projets et cliniques de translation.
Nous ne sommes pas loin de cette réalité. Dans notre projet actuel, par exemple, nous pouvons mesurer le dysfonctionnement endothélial. Une cellule rigide ou une cellule avec un glycocalyx endommagé sont des caractéristiques d'une cellule dysfonctionnelle. Nous pouvons effectuer ces diagnostics dans des projets de laboratoire, mais les cliniciens hésitent à utiliser cette approche pour le moment en raison de la complexité de la machine impliquée.
J'essaie de convaincre différents groupes d'essayer cette approche, les cliniciens nous donnant du sérum et mon équipe fournissant des détails sur le dysfonctionnement endothélial détecté.
À propos du professeur Kristina Kusche-Vihrog
Le professeur Kristina Kusche-Vihrog est directeur du Lübeck Institute of Physiology en Allemagne et au conseil d'administration de la Fondation allemande de l'hypertension. En 2018, elle a reçu le prix de la Société allemande de néphrologie pour la recherche sur l'hypertension. Ses recherches se concentrent en particulier sur l'influence des processus inflammatoires sur le dysfonctionnement endothélial comme précurseur du développement des maladies cardiovasculaires.
