Dans une étude récente publiée dans Natureun groupe de chercheurs a exploré comment l’incorporation de N1-méthylpseudouridine (1-méthylΨ) dans les acides ribonucléiques messagers (ARNm) affecte le décalage du cadre ribosomal et la fidélité globale de la traduction de l’ARNm.
Sommaire
Arrière-plan
Les ARNm thérapeutiques transcrits in vitro (IVT), comme ceux des vaccins COVID-19, contiennent souvent des ribonucléotides modifiés tels que le 1-méthylΨ pour réduire l’immunogénicité et augmenter la stabilité, améliorant ainsi leur efficacité thérapeutique. Alors que certaines modifications comme la 5-méthylcytidine (5-méthylC) sont naturellement présentes dans l’ARNm eucaryote, d’autres comme le 1-méthylΨ ne le sont pas. Ces modifications, notamment la 5-méthoxyuridine (5-méthoxyU) et le 5-méthylC, visent à stimuler la synthèse des protéines recombinantes pour les thérapies à base d’ARNm.
Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre de manière globale comment les ribonucléotides modifiés comme le 1-méthylΨ, le 5-méthoxyU et le 5-méthylC affectent la fidélité de la traduction de l’ARNm, en particulier dans les ARNm thérapeutiques de l’IVT, compte tenu de leur utilisation répandue dans les thérapies et les vaccins et des connaissances limitées actuelles sur leur impact sur la synthèse des protéines.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé diverses méthodes pour synthétiser et analyser l’ARNm modifié. Pour la synthèse des plasmides et de l’ARNm, ils ont utilisé des réactifs polymérase d’acide désoxyribonucléique (ADN) Phusion haute fidélité et ont créé une matrice d’ADN pour la luciférase de luciole de type sauvage (WT) et décalée (Fluc). Des gènes personnalisés ont été transcrits pour différentes modifications d’ARNm à l’aide du kit de transcription TranscriptAid T7 High Yield. Les transcrits ont subi des modifications avec des nucléotides comme le 5-méthoxyUTP, le N1-méthylpseudoUTP ou le 5-méthylCTP et ont été purifiés et quantifiés pour des expériences ultérieures.
Pour l’électrophorèse sur gel d’ARN, les échantillons ont été préparés avec du formamide et des colorants, puis résolus sur des gels d’agarose, colorés au bromure d’éthidium et visualisés sous lumière UV. L’étude impliquait la culture et la transfection de cellules HeLa avec des ARNm modifiés et l’évaluation de l’activité luciférase après transfection. Ils ont également effectué une traduction in vitro à l’aide du système de lysat de réticulocytes Flexi Rabbit, intégrant [35S]méthionine pour l’étiquetage.
L’étude a utilisé l’analyse peptidique par chromatographie liquide – spectrométrie de masse en tandem (LC – MS/MS) pour identifier les produits de traduction, et la spectrométrie de masse pour analyser les digestions en gel. Les données de spectrométrie de masse ont été traitées à l’aide du logiciel Proteome Discoverer. De plus, ils ont effectué une analyse de séquençage d’ARN des ARNm IVT à l’aide du kit NextFlex Rapid Directional RNA-seq et du séquençage Illumina MiSeq.
Pour plus d’informations, ils ont utilisé l’autoradiographie par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide (SDS-PAGE) et ont quantifié l’incorporation [35S]méthionine dans les ARNm traduits. L’aspect immunologique a été exploré à travers des études d’immunisation de souris, des tests Interferon Gamma Enzyme-Linked ImmunoSpot (IFNγ ELISpot) pour mesurer les réponses immunitaires et le génotypage de l’antigène leucocytaire humain (HLA) de donneurs humains pour comprendre la composition génétique liée aux réponses vaccinales.
Les analyses statistiques des données collectées ont été réalisées à l’aide du logiciel R. Cette approche globale a permis aux chercheurs d’étudier de manière approfondie comment les ribonucléotides modifiés affectent la traduction de l’ARNm.
Résultats de l’étude
Dans leur exploration de la façon dont les modifications des ribonucléotides influencent le maintien du cadre de lecture pendant la traduction de l’ARNm, les chercheurs ont développé des ARNm transcrits in vitro (IVT) (Fluc+1FS) en tant que rapporteurs pour la synthèse protéique hors cadre. Ces ARNm ont été conçus pour coder un segment amino-terminal de NFluc et un segment carboxy-terminal complémentaire de Fluc (CFluc) dans le cadre de lecture +1. Normalement traduits, ces ARNm produiraient un NFluc inactif, mais le changement de cadre ribosomal pourrait produire des polypeptides actifs contenant des résidus des deux segments.
L’équipe a synthétisé divers ARNm Fluc+1FS modifiés, incorporant le 5-méthoxyU, le 5-méthylC et le 1-méthylΨ, et a comparé leur traduction avec des ARNm non modifiés. Ils ont découvert que le 1-méthylΨ augmentait significativement le décalage de cadre ribosomal +1 dans la traduction de l’ARNm Fluc+1FS, un phénomène non observé avec d’autres ribonucléotides. Cette découverte a également été répliquée dans des cellules HeLa transfectées avec l’ARNm 1-méthylΨ Fluc + 1FS.
Une enquête plus approfondie a été menée pour mieux comprendre ces produits de traduction avec changement de cadre +1. Le Western blot a révélé que les ARNm 1-méthylΨ, contrairement à d’autres ARNm modifiés, généraient des bandes supplémentaires de poids moléculaire plus élevé, indiquant des polypeptides de décalage de cadre. Compte tenu de l’utilisation du 1-méthylΨ dans les vaccins à ARNm du SRAS-CoV-2, ils ont étendu leur étude in vivo en utilisant BNT162b2, un vaccin contenant du 1-méthylΨ. Ils ont découvert que les souris vaccinées présentaient des réponses significatives des lymphocytes T aux peptides de pointe +1. Cette réponse a également été observée chez les humains vaccinés avec BNT162b2, indiquant que l’ARNm du 1-méthylΨ peut provoquer une immunité cellulaire contre les antigènes peptidiques produits par un décalage de cadre ribosomal +1.
Pour disséquer davantage le mécanisme à l’origine de ce changement de cadre, ils ont effectué une analyse LC-MS/MS sur les produits de traduction de l’ARNm 1-méthylΨ Fluc+1FS, identifiant plusieurs peptides dérivés du cadre +1. Cela conforte l’idée selon laquelle ces polypeptides allongés étaient effectivement chimériques, combinant des résidus en phase et en décalage de cadre. De plus, ils ont étudié si les produits décalés de la traduction de l’ARNm du 1-méthylΨ étaient dus à des erreurs de transcription. Le séquençage de l’ARN de l’ARNm non modifié et 1-méthylΨ Fluc + 1FS suggère que les produits décalés étaient le résultat d’un véritable changement de cadre ribosomal plutôt que d’inexactitudes transcriptionnelles.
L’étude a également examiné comment le 1-méthylΨ dans l’ARNm IVT affecte l’élongation de la traduction, découvrant que la traduction de l’ARNm 1-méthylΨ était plus lente que celle de l’ARNm non modifié, indiquant un blocage du ribosome. Ils ont émis l’hypothèse que ce blocage pourrait être dû à une liaison altérée de l’aminoacyl-ARNt et ont découvert que l’ajout de paromomycine améliorait l’élongation du polypeptide dans la traduction de l’ARNm du 1-méthylΨ.
Conclusion
Compte tenu de ces résultats, les chercheurs ont souligné l’importance d’une conception minutieuse des séquences d’ARNm dans les futures applications technologiques de l’ARNm afin de minimiser les événements de changement de cadre ribosomal. Ils ont démontré que des mutations synonymes dans des séquences glissantes de l’ARNm 1-méthylΨ Fluc+1FS pourraient réduire considérablement le décalage de cadre +1. Ceci suggère qu’avec une conception ciblée de l’ARNm, il est possible d’atténuer les effets du changement de cadre ribosomal induit par la N1-méthylpseudouridylation.
