Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, une équipe de chercheurs a étudié la modification de la stabilité, de l’antigénicité et de l’expression protéique du trimère de protéine de pointe du coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère en utilisant la mutagenèse dirigée pour modifier une cavité au cœur de la protéine de pointe.
Sommaire
Arrière plan
De nombreux vaccins contre la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) sont basés sur la protéine de pointe SARS-CoV-2, et ils ont considérablement réduit la gravité de la maladie. La protéine de pointe se compose de deux sous-unités, S1 et S2, séparées par le clivage de la furine. Le domaine de liaison au récepteur dans la sous-unité S1 se fixe au récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE-2) dans la cellule hôte. La sous-unité S2 contenant le peptide de fusion médie l’entrée virale dans la cellule hôte.
La fusion membranaire est associée à des modifications de la structure enroulée des glycoprotéines virales de classe I, dont la sous-unité SARS-CoV-2 S2 est un exemple. Les positions tournées vers l’intérieur dans la bobine enroulée SARS-CoV-2 S2 sont des résidus polaires qui se rapprochent et forment des liaisons hydrogène dans le trimère de pointe post-fusion. Dans la bobine enroulée du trimère de pointe de préfusion, les résidus d’alanine aux positions 1016 et 1020 forment une cavité dans le noyau hydrophobe formé en raison des interactions entre les résidus d’isoleucine et de leucine aux positions 1013 et 1012, respectivement.
Des études de repliement des protéines ont révélé que de telles cavités de cœur de protéine peuvent déstabiliser la protéine et que la stabilité thermique peut être améliorée en utilisant des résidus hydrophobes plus volumineux pour remplir la cavité. L’utilisation de cette technique pour améliorer la stabilité des antigènes de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 pourrait provoquer des réponses immunitaires plus stables et plus durables aux vaccins.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé un promoteur de cytomégalovirus, des résidus de la glycoprotéine S de la souche ancestrale Wuhan Hu-1, une mutation de clivage de la furine, des substitutions et le domaine C-terminal de la fibritine du bactériophage T4 (pli T4), oct-histidine, et des séquences avitag pour produire le trimère de pointe à deux prolines stabilisé par préfusion S2P-FHA. Des gènes synthétiques qui codaient pour des fragments S2P mutés ont été introduits dans S2P-FHA.
De plus, le vecteur d’expression S2P-1208.H8 comprenant des séquences d’ectodomaine de la souche ancestrale Wuhan Hu-1 et SARS-CoV-2 Omicron BA.1 et BA.4/BA.5 a été dérivé des plasmides S2P-FHA. La chromatographie d’affinité cationique divalente a été utilisée pour purifier partiellement la protéine S2P-FHA. La purification des protéines a ensuite été effectuée en utilisant la chromatographie d’exclusion stérique (SEC) et l’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE).
La thermostabilité de la protéine a été évaluée par fluorimétrie différentielle à balayage. L’analyse Western blot a confirmé l’expression de la glycoprotéine de pointe de type sauvage et mutée dans les cellules transfectées, tandis que la capacité de fusion membranaire des glycoprotéines de pointe a été mesurée à l’aide d’essais de fusion cellule-cellule. L’activité de fusion des protéines de pointe mutées a été déterminée par un test de luciférase.
Des modèles de cobayes ont été utilisés pour déterminer l’immunogénicité des trimères S2P-FHA porteurs de mutations de la cavité alanine. Des virus luciférase du virus de l’immunodéficience humaine pseudotypés Spike ont été utilisés pour déterminer l’activité neutralisante du sérum d’animaux vaccinés. De plus, un dosage immuno-enzymatique (ELISA) par compétition croisée d’anticorps neutralisants sériques monoclonaux a été utilisé pour déterminer les sites antigéniques dans la protéine de pointe ciblée par les anticorps induits par le vaccin.
Résultats
Les résultats ont rapporté une thermostabilité améliorée du trimère de pointe stabilisé par préfusion S2P-FHA après le remplacement du résidu alanine en position 1016 par un résidu hydrophobe plus volumineux. De plus, le remplissage de la cavité alanine 1016/1020 avec des résidus plus volumineux a également augmenté l’activité de fusion membranaire de la glycoprotéine de pointe.
Parmi les divers mutants S2P-FHA produits, deux mutants ont suscité des titres d’anticorps neutralisants élevés contre la souche ancestrale Wuhan-Hu-1 et la variante Delta. Chez l’un des mutants (16L), l’alanine en position 1016 a été remplacée par un résidu leucine, tandis que chez l’autre mutant (VI), les résidus alanine 1016 et 1020 ont été remplacés par la valine et l’isoleucine, respectivement. Cependant, les anticorps neutralisants induits par ces mutants contre le sous-variant Omicron BA.1 étaient comparativement plus faibles.
En outre, les antigènes mutés ont suscité des anticorps neutralisants qui sont entrés en compétition avec le récepteur ACE-2 pour le motif de liaison au récepteur de la pointe et ont reconnu des épitopes dans le domaine N-terminal, le domaine de liaison au récepteur et la tige de la sous-unité S2 de la pointe. Le mutant VI a produit des trimères d’ectodomaine de pointe Omicron BA.1 et BA.4/BA.5 stables sans nécessiter de motif externe de trimérisation du pli T4.
conclusion
Pour résumer, l’étude a enquêté sur la production de trimères de protéine de pointe SARS-CoV-2 thermostables en remplissant la cavité formée entre deux résidus d’alanine dans le noyau enroulé de la sous-unité S2 en remplaçant un ou les deux résidus d’alanine par des résidus hydrophobes plus volumineux.
Les résultats ont indiqué que le mutant VI exprimait de manière stable les trimères d’ectodomaine de pointe des sous-variants Omicron BA.1 et BA.4/BA.5 sans avoir besoin d’un motif de trimérisation externe. Le mutant VI peut produire des vaccins à glycoprotéine trimère de pointe stables pour des doses de rappel afin de renforcer la réponse immunitaire contre les sous-variantes émergentes d’Omicron.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
