Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur, les chercheurs ont exploré le rôle du cadre de lecture ouvert 3c (ORF3c), une protéine accessoire du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) qui n’a pas encore été étudiée de manière aussi approfondie. Ils ont déterminé la localisation cellulaire de l’ORF3c, son rôle dans la modulation de la réponse antivirale de l’hôte (par exemple, l’autophagie) et ses effets sur le métabolisme mitochondrial.
Sommaire
Arrière plan
Étant donné que les variantes du SRAS-CoV-2 continuent d’émerger, il est nécessaire de mieux comprendre ses mécanismes pathogènes pour éclairer les stratégies d’atténuation et de traitement. Des études ont déchiffré deux phases séquentielles de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) avec différentes caractéristiques métaboliques. La première phase est une phase hyper-inflammatoire caractérisée par l’effet Warburg, où la glycolyse aérobie, la production d’adénosine triphosphate (ATP)/énergie et la consommation d’oxygène augmentent.
L’hôte active l’immunité innée et augmente la production d’énergie, très probablement pour combattre l’attaque du SRAS-CoV-2. Cette phase culmine souvent avec la tempête de cytokines. Une deuxième phase hypo-inflammatoire et immuno-tolérante suit dans laquelle la consommation d’oxygène diminue, tandis que la respiration mitochondriale et la production d’ATP reprennent des niveaux normaux, tout comme l’oxydation des acides gras.
Le SRAS-CoV-2 possède un génome d’acide ribonucléique (ARN) simple brin de 30 kilobases. Son ARN génomique à brin positif traduit deux ORF qui se chevauchent, ORF1a et ORF1b, qui, à leur tour, génèrent 16 protéines non structurelles (NSP). Des études génomiques ont également identifié plusieurs cadres de lecture ouverts alternatifs non annotés dans ORF3a, tels que ORF3b, ORF3c et ORF3d. Les analyses de l’interactome hôte-virus suggèrent que ces protéines s’associent physiquement aux protéines du SRAS-CoV-2 et jouent un rôle crucial dans le cycle de vie, l’infection, la réplication et le bourgeonnement du virus. Parmi celles-ci, les interactions avec les protéines mitochondriales humaines semblent particulièrement abondantes.
Plusieurs chercheurs ont suggéré des altérations de la dynamique mitochondriale, y compris la fission et la fusion mitochondriales, comme caractéristique de la pathologie COVID-19. Par exemple, Hans et al. ont montré que la protéine ORF9b se localise dans les mitochondries et antagonise les interférons de type I et III (IFN) en ciblant plusieurs voies de signalisation antivirales innées. Les protéines accessoires à localisation mitochondriale sont très importantes pour identifier les cibles thérapeutiques du COVID-19 et comprendre les mécanismes de la maladie induite par le SRAS-CoV-2. Pourtant, la protéine ORF3c reste non caractérisée et sous-étudiée, peut-être parce que seuls les sarbecovirus codent pour cette protéine. Néanmoins, les données de profilage des ribosomes suggèrent fortement que l’ORF3c est une protéine fonctionnelle.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont étudié les effets du SRAS-CoV-2 ORF3c sur les réponses immunitaires innées, l’autophagie et le métabolisme mitochondrial des cellules pulmonaires. SARS-CoV-2 ORF3c partage 90% d’identité avec SARS-CoV et 95% avec bat-CoV RaTG13. Sa structure protéique complète n’étant pas disponible, les chercheurs ont modélisé les protéines SARS-CoV-2 et bat ORF3c pour prédire leur structure à l’aide du logiciel RoseTTAFold, qui déploie l’algorithme d’apprentissage en profondeur.
De plus, les chercheurs ont étudié la localisation mitochondriale ORF3c par microscopie confocale, pour laquelle ils ont transfecté des cellules HeLa avec le vecteur pDsRed2-Mito. Ils ont également confirmé la localisation mitochondriale d’ORF3c en utilisant les deux lignées cellulaires pulmonaires A549 et HSAEC1. De plus, l’équipe a étudié comment la protéine ORF3c modifiait le métabolisme mitochondrial grâce à l’analyse Agilent Seahorse XF Mito Stress. Par la suite, ils ont étudié la dépendance des mitochondries à divers substrats, à savoir le glucose (pyruvate), la glutamine (glutamate) et les acides gras à longue chaîne, à l’aide du kit de test Seahorse Mito Fuel Flex.
Enfin, l’équipe a étudié les effets de 26 cytokines et chimiokines dans des cellules transfectées avec des vecteurs exprimant ORF3c. Le SRAS-CoV-2 a évolué pour modifier les fonctions mitochondriales afin d’émousser les défenses antivirales de l’hôte. De même, il interfère avec la formation ou la maturation des autophagosomes dans les cellules hôtes, un mécanisme par lequel les cellules hôtes éliminent les agents pathogènes.
Résultats de l’étude
La prédiction structurelle a révélé une architecture ORF3c tridimensionnelle avec deux courtes hélices alpha (α1 et α2) reliées par une région en boucle. L’hélice α2 correspondait à la région transmembranaire prédite. Les protéines SARS-CoV-2 et bat ORF3c différaient par les acides aminés R36K et K40R, ce qui suggérait que ces deux protéines n’avaient pas beaucoup de changements conformationnels. L’analyse par immunofluorescence a révélé que la protéine ORF3c était co-localisée avec la translocase de la membrane externe 70 (TOM70) et TOM20, les deux protéines de la membrane mitochondriale externe. L’analyse de fractionnement dans les cellules HeLa a en outre confirmé que les fractions solubles et insolubles (membranaires) d’ORF3c étaient presque exclusivement localisées dans les mitochondries.
Le taux de consommation d’oxygène en temps réel (OCR) a montré que la protéine ORF3c augmentait la respiration basale et maximale et la synthèse d’ATP mitochondriale. Cependant, les profils de taux d’acidification extracellulaire (ECAR) n’ont montré aucune augmentation de la glycolyse. La surexpression de chaque ORF a entraîné une augmentation du taux d’efflux de protons (PER) provenant des mitochondries et une diminution du PER glycolytique.
Par rapport aux cellules témoins, les mitochondries des cellules transfectées ne pouvaient pas contourner les inhibiteurs de la voie des acides gras grâce à l’utilisation des deux autres carburants. Ils avaient également besoin d’acides gras pour maintenir le taux de consommation basale d’oxygène (OCR). De manière rassurante, les cellules transfectées avec ORF3c, bien que montrant quelques signes légers de stress oxydatif, ont pu amortir les effets négatifs du peroxyde d’hydrogène accumulé en raison de la présence d’une quantité suffisante de piégeurs d’espèces réactives de l’oxygène (ROS).
Bien que l’ORF3c n’ait pas pu modifier l’expression de 62 gènes impliqués dans l’immunité innée et adaptative, l’ORF3c du SRAS-CoV-2 a induit une augmentation des niveaux de LC3-II et de p62 par rapport au contrôle, indiquant une augmentation du nombre d’autophagosomes, tandis que l’ORF3c de la chauve-souris n’a pas affectent les niveaux de marqueurs autophagosomiques.
conclusion
Les données de l’étude suggèrent qu’ORF3c est une protéine accessoire importante qui joue un rôle crucial dans la pathogenèse du SRAS-CoV-2 et la progression du COVID-19. Les chercheurs ont observé que l’ORF3c avait une localisation mitochondriale, un métabolisme mitochondrial altéré et une production accrue de ROS. Il a également empêché la dégradation autophagique en modifiant le pH des lysosomes. Cependant, ORF3c n’a pas modulé l’expression des interférons et des cytokines/chimiokines. Pourtant, on ne sait toujours pas comment ORF3c modifie l’état métabolique des cellules infectées par le SRAS-CoV-2. Ainsi, les futures études devraient étudier le mécanisme détaillé par lequel les protéines accessoires du SRAS-CoV-2 modifient le métabolisme mitochondrial et bloquent le flux autophagique.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
