La réponse immunitaire à l’infection par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), à l’origine de la maladie à coronavirus en cours 2019 (COVID-19), comprend à la fois des réponses humorales et cellulaires. Les anticorps sériques contre le virus le neutralisent en empêchant son entrée dans la cellule et l’établissement réussi de l’infection. D’autres anticorps aident à éliminer le virus du corps.
Un nouveau document de recherche préimprimé publié sur le bioRxiv * serveur fournit une meilleure compréhension de l’aspect de l’immunité humorale contre le virus – les plasmocytes qui déversent un flot d’anticorps spécifiques ciblant divers épitopes sur le pathogène.
Sommaire
Antigène de pointe
L’antigène viral majeur est la glycoprotéine de pointe, composée des sous-unités S1 et S2. La sous-unité S1 contient le domaine de liaison au récepteur (RBD) qui assure la médiation de l’attachement viral au récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) sur la cellule hôte. La sous-unité S2 est responsable de la fusion virale à la membrane cellulaire, après un traitement supplémentaire par la protéase hôte TMPRSS2 et l’internalisation du virus.
S1 est la cible de nombreux anticorps d’immunoglobuline, qui sont souvent neutralisants car les anticorps anti-RBD sont susceptibles d’interagir avec l’interface du virus et le récepteur ACE2, inhibant ainsi l’entrée virale dans la cellule. Les inhibiteurs de TMPRSS2 peuvent également perturber l’amorçage du virus, empêchant ainsi son entrée.
Cellules plasmatiques dans l’infection par le SRAS-CoV-2
Le plasma convalescent contenant des titres élevés d’anticorps neutralisants et plusieurs anticorps monoclonaux thérapeutiques dirigés contre la RBD, et isolé à partir des cellules B de patients COVID-19, est utilisé pour traiter le COVID-19. Il s’agit notamment du bamlanivimab et de l’étesevimab (Eli Lilly), de nombreux autres faisant l’objet d’essais cliniques avancés.
Il est relativement facile d’isoler des anticorps spécifiques du virus en criblant les cellules B mémoire car elles ont des récepteurs de cellules B (BCR) à leur surface. Les formes solubles des antigènes spécifiques auxquels ces BCR sont apparentés, comme le pic ou la RBD, peuvent être utilisées pour marquer le sous-ensemble requis de cellules de liaison à l’antigène et les trier par cytométrie en flux.
Cependant, les clones de cellules B spécifiques de l’antigène représentent moins d’un sur mille des cellules B mémoire totales chez les patients COVID-19, tandis que la nécessité de trier et de cloner des cellules individuelles réduit encore le rendement.
Surtout, les cellules plasmatiques (PC) produisent des anticorps détectés dans le sérum plutôt que dans les cellules B mémoire. Des recherches récentes ont montré que de nombreux anticorps étroitement liés au SRAS-CoV-2 présentent de faibles taux d’hypermutation somatique, similaires aux anticorps germinaux.
Ainsi, les plasmocytes précoces spécifiques de l’antigène dans le sang périphérique peuvent coder pour des anticorps spécifiques et neutralisants contre le virus, malgré le manque apparent de maturation.
Les plasmocytes de transition sont de différents types, des plasmablastes aux PC à courte durée de vie, trouvés dans le sang seulement brièvement avant de migrer dans la moelle osseuse pour former des PC à longue durée de vie. Alors que les PC de transition ne représentent que 5% des cellules B dans le sang périphérique, ils augmentent à près d’un cinquième pendant COVID-19. Cependant, les cellules B à mémoire représentent 40 à 50% des cellules B totales avant et après l’infection par le SRAS-CoV-2.
Les PC expansés clonalement chez les personnes exposées à un antigène ont été associés à une liaison spécifique aux antigènes cibles, mais la pertinence de cette découverte pour les patients atteints de COVID-19 reste à vérifier.
Détails de l’étude
L’étude actuelle a commencé par le développement d’un protocole pour sélectionner les cellules plasmatiques spécifiques de l’antigène de pointe du SRAS-CoV-2. Cela était nécessaire en raison de l’incapacité de sélectionner des PC qui produisent des anticorps spécifiques en utilisant les méthodes d’enrichissement disponibles puisque celles-ci dépendent de l’expression des BCR pour diverses immunoglobulines à la surface cellulaire.
Un flux de travail intégré pour interroger la spécificité des anticorps des PC de patients COVID-19. Le sérum et les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont prélevés sur des patients convalescents COVID-19 (avec un test PCR positif confirmé). Le sérum est dosé par ELISA IgA et IgG ainsi que par POCT. À partir d’un sous-ensemble de 16 patients, les PC sont isolés des PBMC par tri magnétique des cellules, puis subissent une encapsulation sur gel et un code-barres pour le séquençage monocellulaire de leurs transcrits de chaînes lourdes et légères d’anticorps. L’analyse du répertoire d’anticorps est effectuée pour identifier les lignées clonales de cellules plasmatiques élargies, qui sont ensuite reformatées en gènes d’anticorps synthétiques complets ORF uniques comprenant des bras d’homologie, pour permettre l’édition du génome en une seule étape sans clonage. La bibliothèque d’affichage de mammifères résultante subit ensuite un criblage à haut débit pour la liaison de SARS-CoV-2 par cytométrie en flux et séquençage en profondeur pour récupérer l’identité des lignées clonales correspondantes. Le surnageant est utilisé pour déterminer la réactivité croisée des anticorps dans la bibliothèque avec les antigènes de coronavirus.
Les chercheurs ont d’abord utilisé leur protocole pour séquencer le répertoire d’anticorps dans des PC uniques. Ils ont pu identifier les clones expansés de lignées PC en utilisant des séquences de chaînes légères lourdes et variables variables (VH et VL, respectivement). Les répertoires d’anticorps totaux, ainsi que les clones expansés, ont montré l’utilisation d’une large gamme de gènes et de séquences germinales.
Ils ont identifié 45 anticorps avec 80% de similitude de séquence d’acides aminés dans la région déterminant la complémentarité (CDR) H3, formant une lignée clonale.
Ils ont rapidement découvert que la synthèse de milliers de gènes d’anticorps synthétiques correspondant aux séquences d’anticorps expansées n’était pas réalisable, limitant leur utilisation de cet outil. Ils ont néanmoins tenté de répondre à la question de savoir si les PC présentant une forte expansion clonale produisaient des anticorps spécifiques et neutralisants dans COVID-19.
Ils ont sélectionné 132 clones de PC expansés avec les lignées clonales les plus abondantes. Ceux-ci ont montré une large diversité de séquences. Comme prévu, les séquences d’anticorps à commutation de classe d’immunoglobulines avaient plus de 94% d’identité avec les gènes de la lignée germinale, en moyenne, 26 d’entre eux présentant une identité de 100%.
Ceux-ci ont été insérés dans un système de criblage d’affichage de surface d’anticorps de cellules de mammifères par édition du génome, en utilisant la plate-forme CRISPR-Cas9. De cette manière, ils ont introduit des gènes d’anticorps synthétiques dans le locus endogène de l’IGHV sur le génome.
Anticorps spécifiques
Ils ont trouvé 37 anticorps uniques spécifiquement dirigés contre les antigènes du SRAS-CoV-2, issus de clones expansés uniques de 11 patients. Parmi ceux-ci, 11 étaient identiques à la lignée germinale. Ainsi, la plupart des patients COVID-19 avaient des PC provenant de clones hautement expansés, produisant des anticorps spécifiques au virus. Deux patients n’avaient aucun anticorps anti-S.
Les chercheurs ont découvert que deux des anticorps monoclonaux identifiés ici avaient été signalés dans des études antérieures.
Tous les patients n’ont pas montré le même degré de spécificité aux sous-unités S1 ou S2 en raison de taux d’anticorps indétectables contre la protéine S. En outre, l’expansion clonale n’a pas pu être identifiée dans certains cas en raison de la faible profondeur de séquençage monocellulaire.
Les deux bibliothèques d’anticorps créées par la plate-forme d’affichage contenaient des anticorps à réactivité croisée qui se liaient à d’autres coronavirus humains saisonniers, mais pas au SARS-CoV ou MERS (syndrome respiratoire du Moyen-Orient) -CoV hautement pathogène. Cela contraste avec la réactivité croisée plus large trouvée dans d’autres études.
Les anticorps spécifiques aux antigènes du SRAS-CoV-2 n’ont pas réussi à montrer un répertoire familier ou des séquences uniformes, indiquant un large spectre de répertoires d’anticorps dans cette infection. Cependant, les chercheurs ont trouvé des similitudes de séquences avec celles rapportées par les chercheurs précédents. Cela indique que les gènes de la lignée germinale conduisent les réponses anticorps à l’infection par le SRAS-CoV-2.
Là encore, seuls les anticorps anti-S ont été criblés, à l’exclusion de ceux qui se lient à la protéine nucléocapside. Là encore, le changement de format de construction d’anticorps peut avoir affecté l’affinité, la stabilité et l’expression de l’anticorps, provoquant une perte de séquences réactives.
Les chercheurs commentent: «Le nombre total d’anticorps identifiés comme spécifiques du SRAS-CoV-2 dans cette étude est probablement sous-estimé, car tous les candidats regroupés n’ont pas été testés séparément.. »
Anticorps neutralisants
Trois de ces anticorps se sont révélés avoir une puissante activité neutralisante contre la RBD du SARS-CoV-2, en utilisant un test pseudoviral. Deux d’entre eux ont déjà été décrits dans d’autres études. Encore une fois, deux des trois étaient identiques à 100% aux anticorps germinaux mais étaient spécifiques de la RBD.
Deux de ceux-ci semblaient se lier à des épitopes se chevauchant et le troisième à un épitope distinct.
Quelles sont les implications?
« Notre flux de travail intégré de séquençage monocellulaire et de criblage de l’affichage chez les mammifères est en mesure de démontrer que les patients convalescents COVID-19 produisent des PC hautement expansés avec des anticorps spécifiques et neutralisants pour le SRAS-CoV-2. »
Bien que limités, ces résultats servent de preuve de concept, indiquant la capacité de ce pipeline à identifier des anticorps spécifiques avec une affinité de liaison élevée et une capacité de neutralisation puissante, en utilisant une approche de séquençage monocellulaire sur des PC de sang périphérique.
Dans une pandémie, ou lorsqu’une infection doit être diagnostiquée tôt lorsque l’antigène n’est pas disponible pour le test, ou en présence d’un faible nombre de cellules B mémoire contre des antigènes spécifiques, une telle approche pourrait être très bénéfique. Les PC dans le sang périphérique sont également la seule source d’anticorps sériques, à partir desquels les anticorps thérapeutiques sont dérivés.
Avec des améliorations dans le processus de sélection actuel pour les lignées expansées par clonage, un nombre plus important d’anticorps spécifiques à l’antigène pourrait éventuellement être identifié en utilisant cette technologie.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas examinés par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
