L’émergence du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) a déclenché la maladie à coronavirus en cours 2019 (COVID-19). À la fois immunologiquement et biologiquement, la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 représente une cible attrayante pour les chercheurs qui cherchent à contrecarrer ou à neutraliser ce virus.
Une nouvelle étude publiée sur le serveur de prépublication bioRxiv* décrit un système de pseudovirus basé sur le balayage mutationnel profond (DMS) pour démontrer comment les mutations connues et futures pourraient affecter la capacité du SRAS-CoV-2 à échapper à la neutralisation par des anticorps naturels et thérapeutiques.
Étude: Un système de pseudovirus permet une analyse mutationnelle profonde du pic SARS-CoV-2 complet. Crédit d’image : Design_Cells / Shutterstock.com
Sommaire
Introduction
Le DMS est un outil précieux pour prédire comment des milliers de changements génétiques distincts dans la protéine de pointe peuvent affecter le comportement viral médié par les effets sur le repliement des protéines, la fonction des protéines et la liaison des anticorps. En tant que méthode à haut débit, le DMS peut générer de grandes quantités de données idéales pour les méthodes de modélisation informatique afin de prédire le comportement antigénique de nouvelles variantes potentielles du SRAS-CoV-2.
Jusqu’à l’étude actuelle, le DMS était principalement utilisé pour explorer des mutations sur le domaine de liaison au récepteur (RBD) de la protéine de pointe, ou un petit nombre de mutations sur la pointe, en utilisant des systèmes d’affichage de surface cellulaire sur des cellules de levure ou de mammifère. Cependant, cette approche limite la capacité du DMS à mesurer avec précision les effets de neutralisation ; par conséquent, seuls les résultats de liaison des anticorps sont évalués, qui sont souvent moins pertinents sur le plan clinique.
Une nouvelle plateforme DMS
La principale nouveauté de la plate-forme actuelle est son protocole unique conçu pour générer un grand nombre de mutants de pseudovirus dans des bibliothèques, chaque génotype de lentivirus étant lié à une variante spécifique de protéine de pointe de surface. Une telle liaison génotype-phénotype n’est pas typique dans de telles expériences.
Alors que l’absence d’une telle liaison ne pose pas de problème lors de l’utilisation d’une seule variante virale, l’expérience actuelle visait à étudier des milliers de variantes. À cette fin, la nouvelle plate-forme a été utilisée pour cartographier les effets des mutations dans différentes parties du RBD, du domaine N-terminal (NTD) et de la sous-unité S2 de la protéine de pointe sur l’infection cellulaire et la neutralisation des anticorps.
L’approche utilisée dans la présente étude peut générer plus de 105 unités de transduction (pseudovirus liés génotype-phénotype) par millilitre, avec une augmentation supplémentaire de cinq à dix fois possible dans les bonnes conditions.
Les chercheurs n’ont sélectionné que les mutations qui semblaient probables au cours de l’évolution virale naturelle. Ces mutations ont été obtenues à partir de la base de données de la Global Initiative for Sharing Avian Influenza Data (GISAID), représentant ainsi probablement la protéine de pointe fonctionnelle.
Les mutations qui ont émergé plusieurs fois indépendamment ont été utilisées à un taux plus élevé, tandis que les sites présentant une sélection positive ont été interrogés de manière intensive en incluant tous les changements possibles d’acides aminés. Les délétions fréquemment observées ont également été incluses.
Plate-forme d’analyse mutationnelle profonde pour le pic. (A) Lentivirus squelette utilisé pour le balayage mutationnel profond. Le squelette contient des régions lentivirales fonctionnelles à répétition terminale longue (LTR) 5′ et 3′. Le gène de pointe est sous un promoteur d’élément de réponse tet inductible de 3ème génération (TRE3G), et il y a un code à barres de 16 nucléotides (BC) en aval du codon d’arrêt. Un promoteur CMV dirige l’expression du gène rapporteur ZsGreen qui est lié à un gène de résistance à la puromycine (PuR) via un lieur T2A. Le squelette contient également un élément régulateur post-transcriptionnel du virus de l’hépatite de la marmotte (WPRE), un élément de réponse Rev (RRE) et un tractus polypurique central (cPPT). (B) Approche pour créer des bibliothèques de lentivirus liées génotype-phénotype. Les cellules HEK-293T sont transfectées avec un squelette de lentivirus porteur de pointes, un plasmide d’expression VSV-G et des plasmides auxiliaires lentiviraux pour générer des lentivirus pseudotypés VSV-G. Ces virus sont utilisés pour transduire le transactivateur contrôlé par la tétracycline inverse (rtTA) exprimant des cellules HEK-293T à faible multiplicité d’infection (MOI), et les cellules transduites avec succès sont sélectionnées à l’aide de puromycine. Les cellules sélectionnées peuvent être transfectées avec des plasmides auxiliaires et un plasmide d’expression VSV-G pour produire des virus pseudotypés VSV-G portant tous les génomes présents dans la bibliothèque mutationnelle profonde ou des cellules sélectionnées peuvent être induites avec de la doxycycline (dox) pour exprimer la pointe et transfectées avec seulement les plasmides auxiliaires pour générer des lentivirus pseudotypés en pointe qui ont un lien génotype-phénotype. (C) Nombre moyen de mutations par pic à code-barres dans les bibliothèques BA.1. (D) Nombre total de variantes à code-barres dans chaque bibliothèque BA.1. (E) La couverture des mutations prévues dans toutes les bibliothèques BA.1.
Une bibliothèque de 7 000 mutations dans la pointe de variante Omicron BA.1 et presque le même nombre de mutations de pointe de variante Delta ont été utilisées pour l’étude actuelle. La méthode actuelle a utilisé deux ou trois mutations de codons dans chaque variante de pointe à transduire, permettant ainsi d’évaluer l’effet de chaque mutation par rapport à l’arrière-plan d’autres mutations d’accompagnement.
Chacune de ces mutations a reçu son propre code-barres après avoir intégré le pseudovirus dans sa cellule hôte finale.
Il est important de noter que la liaison des codes-barres aux variantes de pointe nous permet d’utiliser le séquençage Illumina à lecture courte du code-barres pour obtenir le génotype de pointe complet dans toutes les expériences ultérieures.”
Avec le protocole génotype-phénotype, deux et trois bibliothèques de variantes Delta et BA.1 ont été créées, contenant respectivement 50 000 et 100 000 variantes chacune. Ces bibliothèques se sont vu attribuer des scores fonctionnels reflétant leur capacité à infecter une cellule hôte par rapport à la variante de pointe parentale. Les mutations non synonymes avaient souvent de mauvais scores, surtout lorsqu’elles étaient multiples, « reflétant le coût de l’accumulation de multiples mutations souvent légèrement délétères.”
Les chercheurs ont également ajouté un pseudovirus à code-barres avec une variante de pointe résistante à tous les anticorps anti-pointe. Cela a fourni une norme de neutralisation absolue dans laquelle les changements dans le nombre de codes à barres de pseudovirus pour cette variante et d’autres pourraient être comparés pour calculer le degré de changement de neutralisation pour chaque variante par rapport à cette variante.
Qu’a montré l’étude ?
Un cas test utilisant un ensemble d’anticorps neutralisants BA.1 (nAbs) ciblant le RBD (LY-CoV1404 ou bebtelovimab), NTD (5-7) et S2 (CC67.105) a ensuite été mené.
Le bebtélovimab est resté puissant contre Omicron en raison de son épitope RBD. Alors que certaines mutations d’Omicron au niveau des sites d’échappement de l’épitope du bebtélovimab ont peu d’effet, d’autres se sont échappées. Comme de nouvelles mutations K444 sont détectées dans les nouvelles sous-variantes d’Omicron, le bebtélovimab pourrait éventuellement perdre sa puissance actuelle.
Des résultats similaires ont également été obtenus avec les deux autres anticorps, dans lesquels des sites, où un échappement complet peut être produit, ont été identifiés.
L’étendue de la neutralisation, c’est-à-dire la capacité de neutraliser les épitopes pan-sarbecovirus, ne confère pas de puissance contre le SRAS-CoV-2. Cela est dû à la présence de mutations détectées dans certaines sous-variantes d’Omicron qui permettent également une évasion complète des anticorps largement neutralisants.
[This] souligne l’importance de cartographier directement les mutations d’échappement dans le SRAS-CoV-2 en plus d’évaluer l’étendue des autres coronavirus naturels liés au SRAS.”
L’effet de diverses mutations sur l’infection virale en l’absence d’anticorps a également été exploré. À cette fin, la plateforme pourrait identifier différents effets délétères et bénéfiques pour diverses mutations. Les chercheurs ont également examiné comment les effets fonctionnels pourraient refléter l’évolution réelle du virus.
Fait intéressant, les résultats étaient précis par rapport aux observations du monde réel par rapport aux expériences précédentes, « probablement parce que nos expériences imitent mieux la véritable fonction biologique de la pointe que les expériences d’affichage de la surface cellulaire.” Néanmoins, les mutations avec des scores fonctionnels positifs ne se sont pas enrichies au cours de l’évolution naturelle, peut-être en raison de la différence des pressions de sélection entre le laboratoire et les environnements naturels.
Les premières mutations D614G restent inégalées dans leur capacité à améliorer l’infectivité.
conclusion
Pris ensemble, les résultats de l’étude fournissent des mesures à grande échelle très précises de l’impact des mutations de pointe. Ainsi, la plate-forme discutée ici pourrait aider à identifier les futures mutations d’échappement potentielles les plus probables.
La nouvelle plate-forme décrite dans la présente étude pourrait être inestimable pour évaluer l’évasion directe de la neutralisation dans les sérums polyclonaux, qui affecte souvent différemment la liaison et la neutralisation des anticorps. En outre, cette méthode peut être utilisée pour évaluer de nouvelles variantes de pointe et ainsi diriger la conception rationnelle de vaccins.
Les chercheurs indiquent également que leur plate-forme fournit de nouvelles directions pour le développement d’anticorps thérapeutiques en révélant à quel point les anticorps neutralisants restent largement sensibles aux mutations d’échappement immunitaire dans le SRAS-CoV-2, soulignant ainsi l’importance des régions de pointe conservées.
Le lien entre génotype et phénotype viral est essentiel pour comprendre comment les pressions de sélection naturelle affectent l’évolution de la protéine de pointe. Il est important de noter que cette plate-forme peut être utilisée pour tout virus pouvant être pseudotypé pour la surveillance antigénique et la conception de vaccins.
Compte tenu de la possibilité d’introduire un gain de fonction dans des agents pathogènes pandémiques potentiels, de telles expériences doivent être réglementées de manière appropriée pour éviter de créer de nouveaux risques tout en faisant progresser les avantages pour la santé publique.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
