L’étude explore la sélectivité de substrat de la réplicase SARS-CoV-2

Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de prétirage, les chercheurs ont exploré les facteurs affectant la sélection du substrat par la réplicase du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2).

À ce jour, il y a eu plus de 5,26 millions de cas confirmés de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), dont 6,27 millions de décès signalés dans le monde. Cela a nécessité des recherches approfondies pour comprendre le cycle de vie du SRAS-CoV-2 et développer des méthodes thérapeutiques pour le prévenir.

À propos de l’étude

Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé la microscopie cryoélectronique pour étudier le complexe de réplication-transcription (RTC) lié à chaque nucléotide triphosphate (NTP) trouvé dans le SRAS-CoV-2.

L’équipe a évalué diverses approches chimiques pour bloquer les complexes de pré-incorporation du SARS-CoV-2 RTC après la liaison au substrat. Les méthodes étudiées comprenaient l’utilisation de substrats de nucléotide diphosphate (NDP), d’analogues de nucléotides non hydrolysables α-β, de cofacteurs métalliques alternatifs, y compris Ca²⁺, et les échafaudages d’acide 3′-désoxy p-ribonucléique (ARN). L’équipe a démontré l’efficacité des échafaudages d’ARN 3′-désoxy en utilisant la spectrométrie de masse native (nMS) pour évaluer l’extension de l’amorce par une base ou la génération d’un complexe ternaire. En outre, des échantillons cryo-EM de RTC ont été préparés pour chaque nucléotide naturel, ATP, GTP, CTP, UTP ou RDV-TP.

Résultats

Les résultats de l’étude ont montré que les substrats NDP capturaient efficacement le complexe de reconnaissance de l’ARN polymérase dépendante de l’ARN (RdRp) du virus de l’hépatite C (VHC). Cependant, le RTC du SRAS-CoV-2 a montré une incorporation suffisante de guanosine diphosphate (GDP), d’adénine DP (ADP) et, dans une moindre mesure, d’antiviraux remdesivir diphosphate (RDV-DP). Ceci a indiqué l’efficacité de SARS-CoV-2 dans l’incorporation de NDP aussi bien que la promiscuité relative du site actif à RdRp. L’équipe a également noté que l’activité de synthèse RTC était réduite après l’introduction d’un 3′-désoxynucléotide dans le produit-ARN (p-ARN).

Les chercheurs ont observé que dans le cas d’échafaudages témoins comprenant du 3′-OH, une extension d’un seul nucléotide monophosphate (NMP) se produisait dans le p-ARN presque complet. Notamment, en l’absence de 3′-OH dans les p-ARN, aucune incorporation n’a été trouvée dans le nucléotide suivant, qui pourrait être l’ATP, le GTP ou le RDV-TP. Cela indiquait que la présente stratégie piégeait efficacement les complexes de pré-incorporation.

La préparation des échantillons cryo RTC a montré que deux des structures résultantes, les RTC avec GTP ou CTP, avaient une résolution nominale de plus de 3 Å avec une résolution locale de près de 2,2 Å permettant une résolution au niveau quasi atomique. D’après l’existence de chlorure de magnésium (Mg²⁺) dans le tampon cryogénique et les géométries de coordination octaédriques, l’équipe a attribué les caractéristiques de densité du CTP et du GTP à Mg²⁺_UN et Mg²⁺_B. Les pics de densité pour Mg²⁺_UN dans les structures GTP et CTP étaient plus faibles que celles trouvées dans Mg²⁺_B tandis que les caractéristiques de densité pour Mg²⁺_UN n’ont pas été trouvés dans les structures ATP et RDV-TP.

Fait intéressant, la fermeture du site actif trouvé autour de l’ATP entrant était une caractéristique cohérente dans toutes les structures. L’équipe a noté que la fermeture du motif stabilisait la liaison au substrat en : (1) facilitant le carbonyle du squelette de Y619 dans la coordination de Mg²⁺_B et le résidu catalytique D618 en coordonnant les deux Mg²⁺_UN et Mg²⁺_B; (2) permettant la génération d’un réseau de liaisons hydrogène (liaison H) pour améliorer la détection du substrat ribose 3′-OH ; (3) permettant des interactions de liaison faibles entre les résidus de motifs et les β- et γ-phosphates ; et (4) briser la polaire dans le RTC pour permettre le repositionnement pour la coordination du métal.

L’équipe a noté que les interactions des 12 résidus de la protéine non structurale (nsp) et des substrats NT naturels étaient comparables, à l’exception des résidus conservés. De plus, la structure de fermeture du motif SARS-CoV-2 RdRp était similaire aux complexes RdRp liés au substrat trouvés dans le VHC et le poliovirus. De plus, les structures de résidus ont été conservées dans les principaux clades de CoV ainsi que dans les séquences du SRAS-CoV-2 trouvées chez les patients infectés. Cela indique que le site actif CoV RdRp est presque immuable.

L’évaluation de la sélectivité structurale a montré que les nucléotides RDV-TP et ATP étaient tous deux appariés par bases ; cependant, le fragment 1′-cyano trouvé sur le ribose RDV-TP formait la différence clé entre les deux nucléotides. Cette fraction cyano a créé un réseau d’interactions polaires à travers les résidus. De plus, une molécule d’eau stable a été trouvée en l’absence du groupe cyano, ce qui suggère que le RDV-TP avait une affinité plus élevée que l’ATP.

Conclusion

Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont mis en évidence la plus grande sélectivité du RDV, rendue possible par la présence de la fraction cyano, tandis que les mutations affectant l’hydrophilie du site actif RdRp augmentaient la résistance au RDV. Les chercheurs pensent que la reconnaissance NTP peut être utilisée pour concevoir des analogues de nucléotides afin de développer des approches thérapeutiques qui ciblent le SARS-CoV-2 RdRp.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.