Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont découvert et optimisé des inhibiteurs covalents à base de pyrazoline réactifs à la cystéine pour la protéase principale de plusieurs coronavirus (Mpro), y compris le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2).
Sommaire
Contexte
La protéine de pointe (S) en constante mutation modifie et réduit l’efficacité des vaccins et des anticorps thérapeutiques actuellement utilisés ciblant le SRAS-CoV-2. Parmi plusieurs gènes et protéines conservés à travers les coronavirus, la protéase Mpro ou 3C-like (3CLpro) est indéniablement la cible la plus attractive pour le développement de thérapies antivirales.
La combinaison de médicaments oraux approuvée par la Food and Drug Association (FDA) de nirmatrelvir boosté par le ritonavir, commercialisée sous le nom de Paxlovid, est un inhibiteur de Mpro et est largement utilisée pour le traitement de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Malgré la disponibilité de Paxlovid, il reste encore de la place pour découvrir d’autres inhibiteurs de Mpro qui pourraient être utilisés pour la découverte et le développement de médicaments, conduisant à des traitements encore plus efficaces. De plus, il peut y avoir l’émergence d’une résistance contre Paxlovid, nécessitant des inhibiteurs supplémentaires de Mpro.
L’enzyme Mpro agit comme un catalyseur pour plusieurs événements de traitement protéolytique facilitant la réplication des coronavirus à l’intérieur des cellules hôtes. Étant donné que la cystéine (C145) entraîne l’activité catalytique de Mpro, le ligand covalent à base de pyrazoline réactif à la cystéine semble naturellement attrayant pour le développement d’inhibiteurs de Mpro qui peuvent interagir de manière irréversible avec le Mpro C145. Dans l’ensemble, l’inhibition de Mpro avec un antiviral pourrait empêcher efficacement la réplication des coronavirus, offrant un bénéfice thérapeutique.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé des approches basées sur le profilage des protéines basées sur l’activité (ABPP) basées sur gel pour cribler une bibliothèque de 582 acrylamides et chloroacétamides. La sonde d’iodoacétamide fonctionnalisée avec la rhodamine réactive à la cystéine (IA-rhodamine) est entrée en compétition avec les ligands covalents réactifs à la cystéine dans le criblage ABPP.
Ensuite, ils ont testé quatre ligands chloroacétamides à base de pyrazoline EN71, EN82, EN216 et EN223 dans un test d’activité basé sur le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) utilisant un substrat peptidique Mpro pour identifier les composés qui inhibaient l’activité Mpro. Pour détecter les inhibiteurs puissants avec une concentration inhibitrice de 50 % (IC50) valeurs <100 nM, ils sont passés de la sonde peptidique à base de FRET à un test d'activité de substrat Mpro à base de rhodamine qui nécessitait des concentrations de Mpro inférieures à 115 nM.
Les chercheurs ont également effectué un profilage chimioprotéomique de la réactivité de la cystéine EN82 dans le lysat de cellules HEK293T pour déterminer si ce composé présentait un certain degré de sélectivité ou s’il était non spécifique. En outre, à l’aide d’un flux de travail de chimioprotéomique covalente basé sur la spectrométrie de masse rapide, ils ont analysé quantitativement les sites de cystéine en concurrence avec EN82. Les lysats de cellules HEK293T enrichis de SARS-CoV-2 Mpro ont été prétraités avec un véhicule ou 10 µM d’EN82 et ensuite marqués avec une sonde d’enrichissement à base d’iodoacétamide réactive à la cystéine clivable à l’acide.
Les chercheurs ont également réalisé des études de relation structure-activité (SAR) autour du noyau central de pyrazoline pour optimiser la puissance des échafaudages chimiques découverts.
Enfin, ils ont utilisé un test d’activité de peptide de substrat basé sur Agilent RapidFire (plus sensible et nécessitant beaucoup moins de protéine Mpro par rapport aux tests d’activité à base de rhodamine) pour évaluer comparativement les puissances des meilleurs ligands covalents découverts au cours de l’étude. De même, ils ont testé plusieurs composés di- et tri-substitués, dont le PM-2-071, contre un panel d’enzymes Mpro du SRAS-CoV-2 et d’autres anciens coronavirus.
Résultats de l’étude
Les ligands de chloroacétamide à base de pyrazoline EN71, EN82, EN216 et EN223 ont démontré une inhibition dose-dépendante du marquage Mpro IA-rhodamine. De tous les quatre ligands, la pyrazoline EN82 a affiché la puissance la plus élevée contre le SARS-CoV-2 Mpro avec un IC apparent50 valeur de 0,16 µM (pour un temps d’incubation de 30 minutes) par rapport à 0,52-4,8 µM pour EN216, EN71 et EN223.
Lors d’un test à base de rhodamine, EN82 a montré une IC apparente50 valeurs de 0,091 µM, 0,059 µM et 0,56 µM contre Mpro du SRAS-CoV-2, du SRAS-CoV-1 et du coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV), respectivement.
Mpro C145 est apparu comme la cible principale d’EN82 avec un seul HMOX2 C282 hors cible parmi plus de 1000 cystéines modifiées par sonde quantifiées distinctes, suggérant ainsi qu’il avait un degré élevé de sélectivité à l’échelle du protéome.
La plupart des composés testés par le test d’activité peptidique du substrat basé sur Agilent RapidFire ont inhibé Mpro de plusieurs coronavirus. Le CI apparent50 les valeurs de ces tests étaient de l’ordre du nanomolaire ; par exemple, PM-2-071 avait ICannées 50 <2nM à travers le SARS-CoV-2, le coronavirus humain HKU1 (HCoV-HKU1) et le coronavirus humain OC43 (HCoV-OC43). Ainsi, l'échafaudage PM-2-071 est apparu comme un candidat prometteur pour une optimisation supplémentaire en tant qu'inhibiteur pan-coronavirus Mpro.
Les explorations SAR du noyau de pyrazoline ont révélé la stéréochimie relative aux carbones C4 et C5. Bien que certains des inhibiteurs optimisés, tels que PM-2-071, aient eu des problèmes liés à la stabilité métabolique, à la solubilité et à la perméabilité cellulaire et n’aient montré aucune activité antivirale contre le SRAS-CoV-2 ; cependant, le substituant C3 5-chloro-2-fluorophényle (CMZ-53), une pyrazoline 3,5-disubstituée, a permis d’améliorer presque trois fois la puissance par rapport à EN82.
conclusion
La présente étude a découvert des inhibiteurs SARS-CoV-2 Mpro très puissants basés sur des chloroacétamides et des vinylsulfamides à base de pyrazoline. À l’avenir, une optimisation plus poussée de ces puissants inhibiteurs de Mpro pourrait améliorer leur efficacité antivirale et promouvoir leurs propriétés de type médicament. Néanmoins, ces ogives réactives à la cystéine représentaient un point de départ solide pour développer des inhibiteurs de Mpro pan-coronavirus non peptidiques plus avancés et plus médicamenteux avec des puissances remarquables.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
