Une étude récente publiée dans Nutriments a développé un nouveau test à haut débit pour évaluer le peptide antimicrobien cathélicidine (CAMP).
Sommaire
Arrière-plan
Les cathélicidines présentent une activité à large spectre contre les bactéries gram-positives et négatives, les agents pathogènes viraux et les champignons. Les cellules immunitaires innées, telles que les cellules dendritiques, les monocytes, les neutrophiles et les macrophages, expriment le gène CAMP humain.
La vitamine D est cruciale pour l’expression du CAMP, et des niveaux déficients ont été associés à des taux plus élevés de pneumonie, de grippe, de vaginose bactérienne, de tuberculose et d’infection des voies respiratoires supérieures.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont développé un nouveau test CAMP à haut débit (HiTCA).
Des répétitions palindromiques regroupées régulièrement intercalées (CRISPR) / CRISPR-associated protein 9 (Cas9) – knock-in du rapporteur de gène fluorescent mCherry a été réalisée à l’extrémité 3 ‘du CAMP gène dans la lignée cellulaire monocyte-macrophage SC. Des ribonucléoprotéines avec Cas9 et un ARN guide unique modifié (sgRNA) ciblant l’extrémité 3′ du gène CAMP ont été générés.
De plus, des plasmides donneurs avec mCherry flanqués de bras homologues de la cible ont également été synthétisés. Les plasmides donneurs et les complexes Cas9-sgRNA ont été électroporés dans des cellules SC. L’ADN génomique a été isolé, amplifié et séquencé. Les pools de cellules ont été ensemencés à l’aide d’une imprimante à cellule unique pour générer des populations de cellules monoclonales.
Les chercheurs ont identifié une population monoclonale de cellules SC humaines CAMPmCherry homozygotes (cellules HiTCA). Les cellules HiTCA et SC de type sauvage (WT) ont été cultivées dans des milieux pour l’entretien et périodiquement testées pour la viabilité. Les cellules HiTCA ont été incubées avec du sérum humain et des métabolites de traitement, tels que les métabolites de la vitamine D ou l’éthanol. Ils ont été incubés pendant 24 heures et une analyse par cytométrie en flux à haut débit a été effectuée. Les cellules WT ont servi de témoins négatifs.
L’équipe a testé la réactivité des cellules HiTCA à la 25-hydroxyvitamine D3 (25(OH)D3) via sa catalyse à la 1,25-dihydroxyvitamine D3 (1,25(OH)2D3) par le membre 1 de la sous-famille B de la famille 27 du cytochrome P450 (CYP27B1 )-hydroxylase. L’effet du sérum humain sur la réponse CAMP a été évalué par co-incubation de cellules HiTCA avec des sérums humains regroupés. En outre, le test à haut débit a été testé dans une expérience pilote utilisant des sérums de cinq hommes blancs et cinq hommes noirs.
Résultats
Les chercheurs ont observé une réponse dose-dépendante des cellules HiTCA au 25(OH)D3. Les cellules traitées à l’éthanol et 1 nM 25 (OH) D3 ont montré une expression de base (10% CAMPmCherry). Ceci a augmenté à 50 % et 100 % avec 10 nM et 100 nM de 25(OH)D3, respectivement, comparables aux niveaux observés dans les cellules traitées avec 1,25(OH)2D3. Cela suggère que les cellules HiTCA pourraient convertir le 25(OH)D3 inactif en 1,25(OH)2D3 actif.
L’incubation des cellules HiTCA avec des sérums humains a provoqué une atténuation de l’expression de CAMPmCherry de manière dose-dépendante. La réponse aux sérums était constante dans toutes les conditions de traitement par métabolite. Dans l’expérience pilote avec des sérums de donneurs humains, l’équipe a utilisé des concentrations sériques de 0,3 % et 10 % pour examiner si la différence CAMP l’expression s’est produite.
De même, l’expression de HiTCA CAMPmCherry a été atténuée à une concentration sérique de donneur de 10 % par rapport à 0,3 %. Notamment, à la concentration la plus faible (0,3 %), la réponse de CAMPmCherry était cinq à sept fois élevée avec 1,25(OH)2D3 10 nM et 25(OH)D3 100 nm. La réponse CAMPmCherry dans les sérums des mâles noirs était plus élevée que celle des mâles blancs, même si les taux sériques de 1,25(OH)2D3 et 25(OH)D3 étaient plus faibles dans les échantillons noirs.
conclusion
En résumé, les chercheurs ont développé HiTCA qui répond aux limitations associées à un précédent ex vivo Essai CAMP dans un flux de travail à haut débit entièrement évolutif. La réponse CAMPmCherry a été fortement induite par la 25(OH)D3 exogène ou la 1,25(OH)2D3 sans sérum. Néanmoins, lorsque du sérum a été ajouté, la réponse CAMPmCherry a été fortement atténuée. Un raffinement et des tests supplémentaires de ce test peuvent s’avérer utiles pour identifier les facteurs sériques qui influencent la fonction immunorégulatrice de la vitamine D.
