Caractérisant avec précision le micro-environnement tumoral lorsque l’accès à l’échantillon de tissu est limité peut être un clé challenge en immuno-oncologie champ. L’équilibre et l’infiltration tumorale de T–les sous-populations cellulaires sont de important intérêt. Dans cette interview, NewsMedical parle à Recherche Cerba sur l’utilisation et la valeur du multiplex d’immunochimie T-régulatrice pour la validation analytique des tumeurs solides.
Sommaire
Que sont les cellules T et pourquoi sont-elles importantes ?
Les lymphocytes T sont généralement classés en cellules auxiliaires (Th), cytotoxiques (Tcyto), mémoire ou régulatrices (Treg). Les lymphocytes T sont considérés comme des cellules effectrices immunitaires importantes, ce qui en fait des cibles privilégiées pour l’immunomodulation. Les cellules Tcyto délivrent des réponses immunitaires optimales et protègent contre les microbes envahisseurs et les antigènes tumoraux. Dans des conditions homéostatiques, les Tregs favorisent la tolérance périphérique. Cependant, en ce qui concerne les tumeurs, les Tregs peuvent supprimer les fonctions des cellules Tcyto.
Qu’est-ce que le protocole multiplex et comment a-t-il été développé ?
Cerba Research a développé le protocole multiplex, Histoprofile®– Panel lumineux T-reg, utilisant la plateforme Discovery ULTRA (Ventana), qui a été conçue pour colorer des sous-populations de lymphocytes T spécifiques sur une seule lame. Cela a évité le besoin de coupes en série à partir des précieux échantillons d’un patient fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) dans les essais cliniques tout en offrant une analyse complète du microenvironnement tumoral.
Le protocole multiplex a été optimisé et pré-validé sur un échantillon FFPE de cancer du poumon non à petites cellules. La validation analytique comprenait des tests de spécificité, de sensibilité, de précision et de stabilité de l’antigène sur des échantillons sains d’amygdales (contrôle) et pathologiques de sein, de poumon, de tête et de cou et de côlon provenant de la biobanque Cerba Research Montpellier.
Pouvez-vous décrire une application spécifique impliquant l’Histoprofile®– Protocole multiplex du panneau lumineux T-reg ?
Pour évaluer Histoprofile®– Spécificité du protocole de lumière T-reg, le protocole multiplex a été utilisé pour étudier des échantillons d’amygdales humaines saines (témoins négatifs/positifs). Une TMA multi-tissus saine approuvée par la FDA comprenait 33 tissus différents provenant de trois donneurs. Dans cette application, un pathologiste a validé la spécificité des trois biomarqueurs sur tous les tissus testés.
L’histoprofil®-Le protocole de lumière Tregs a été testé sur une gamme d’échantillons FFPE de tumeur solide, y compris le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC), le cancer du sein triple négatif (TNBC), le carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSCC) et le cancer colorectal (CRC ).
Une TMA de cancer multi-organes a complété des blocs de tissus pour évaluer un nombre suffisant d’échantillons pour chaque indication. Un pathologiste a ensuite noté les lames pour donner une analyse semi-quantitative des cibles et confirmer la spécificité.
Quelle est la précision analytique de l’histoprofil®– Panneau lumineux T-reg évalué ?
Pour évaluer la précision analytique de l’Histoprofile®-Protocole de lumière T-reg, nous avons effectué une reproductibilité intra-série et inter-séries sur deux échantillons de cancers du sein, du poumon, colorectal et de la tête et du cou. Dans cette évaluation, les lames ont été analysées avec Halo pour la densité cellulaire. Le CV moyen de tous les échantillons a ensuite été calculé pour chaque type de tissu et tumeurs solides.
Lors de l’utilisation de densités cellulaires positives pour CD3, CD8 et FoxP3 comme lecture du protocole, il est possible de répondre aux critères d’acceptation (CV<20 %) pour les tumeurs solides. Pour CD3, le CV est de 21%, mais chez Cerba Research, nous considérons cela suffisant en raison d'une faible densité cellulaire positive (<5% des cellules totales).
Comment procédez-vous pour tester la stabilité de l’antigène ?
Pour évaluer la stabilité des cibles dans l’histoprofil®-Protocole de lumière T-reg, une expérience de cinétique est nécessaire pour analyser le même échantillon vieilli sur une période de temps (de frais jusqu’à trois mois). Ce test est généralement effectué à l’aide de deux échantillons par indication, avec différentes plages d’expression du signal.
Au fil du temps, les images résultantes d’un échantillon NSCLC ont été évaluées avec le logiciel d’analyse d’images Halo. Les lames incluses dans le test de stabilité ont été analysées avec le logiciel Halo pour établir la densité cellulaire de chaque cible du multiplex.
Quels sont les biomarqueurs clés qui indiquent un traitement efficace ?
L’infiltration de lymphocytes T dans la tumeur est un biomarqueur clé pour estimer la réponse aux thérapies immunitaires aux points de contrôle. Dans une étude particulière, cinq échantillons de cancer colorectal (CRC) ont été colorés avec l’Histoprofile®-Panneau lumineux T-reg puis analysé avec Halo pour déterminer les densités de lymphocytes T CD8 et de cellules Treg dans les compartiments tumeur et stroma, et les densités des populations cellulaires à la frontière tumeur/stroma.
Dans ce cas particulier, il y avait significativement plus de Tregs dans le stroma que dans la tumeur (p = 0,026). De même, plus de lymphocytes T étaient présents dans le compartiment stromal que dans la tumeur, mais pas à un niveau significatif (p = 0,096). Une accumulation des lymphocytes T et des cellules Treg du côté stromal de l’interface a été observée.
Qu’est-ce qui rend l’histoprofil®– Le protocole de multiplexage du panneau lumineux T-reg est-il un outil exceptionnel pour l’étude des populations de cellules T ?
Après avoir démontré une spécificité et une sensibilité claires, les performances analytiques de l’Histoprofile®-Le protocole de lumière T-reg utilisant anti-CD8, anti-CD3 et anti-FoxP3 a indiqué la capacité de détecter les cellules Tcyto et Treg dans une gamme de tumeurs solides, y compris, mais sans s’y limiter, les poumons, la tête et le cou, le sein et tissus FFPE de cancer colorectal. Le protocole répondait aux critères d’acceptation en matière de répétabilité et de reproductibilité inter-essais.
La stabilité de l’antigène montre qu’il est possible de détecter des antigènes à un niveau similaire à des coupes fraîches après trois mois. Chez Cerba Research, l’Histoprofile®-Le protocole de lumière T-reg a été validé sur des tumeurs solides à un niveau expérimental.
L’analyse spatiale du protocole fournit une analyse approfondie du microenvironnement tumoral, permettant l’appréciation de l’infiltration des cellules immunitaires dans la tumeur. Nous pensons que l’Histoprofile®– Le panneau lumineux T-reg est un outil pratique qui facilite l’étude des populations de lymphocytes T dans diverses tumeurs solides humaines lors d’essais cliniques.
Figure 1. Comparaison de la densité cellulaire entre les lames simplex et multiplex. Crédit d’image : Recherche Cerba
Figure 2. Évaluation de la spécificité sur des échantillons FFPE d’amygdales saines. Images représentatives de deux échantillons d’amygdales colorés avec l’Histoprofile®-Panneau lumineux Tregs. CD3 (rouge), CD8 (orange) et FoxP3 (vert). Barre d’échelle : 50 μm. Crédit d’image : Recherche Cerba
Figure 3. Carte thermique des résultats de spécificité obtenus sur les blocs d’amygdales saines et la TMA multi-organes saine. Le nombre représente le nombre d’échantillons colorés pour chaque tissu et chaque cible dans chaque pourcentage de plage de cellules positives. Crédit d’image : Recherche Cerba
Figure 4. Heat Map des résultats de sensibilité obtenus sur Blocks et Multi-organ TMA. Le nombre représente le nombre d’échantillons colorés pour chaque tissu et chaque cible dans chaque pourcentage de plage de cellules positives. Crédit d’image : Recherche Cerba
Figure 5. Images représentatives de l’évaluation de précision de l’histoprofil®-Protocole T-reg light sur NSCLC, TNBC, HNSCC et CRC. CD3 (rouge), CD8 (orange) et FoxP3 (vert). Barre d’échelle = 100 μm. Crédit d’image : Recherche Cerba
Figure 6. Graphique de distribution des lames de test de reproductibilité. Densités cellulaires CD3 (rangée du haut), CD8 (rangée du milieu) et FoxP3 (rangée du bas) en fonction de l’échantillon et des indications. Crédit d’image : Recherche Cerba
Figure 7. Évaluation de la stabilité des CD3/CD8/FoxP3 sur le NSCLC. De haut en bas : fusionner, CD3 (rouge), CD8 (orange), FoxP3 (vert). Barre d’échelle = 100 μm. Crédit d’image : Recherche Cerba
Figure 8. Images représentatives de l’analyse spatiale à l’aide de HaLo (la ligne verte représente l’interface tumeur/stroma. Image de gauche : histoprofil®-Panneau lumineux Tregs CD3 (rouge), CD8 (orange), FoxP3 (vert). Image du milieu : Masques Halo pour les lymphocytes T (en haut) et les Tregs (en bas). Image de droite : représentation en halo des zones évaluées lors de l’analyse de l’interface. Chaque couleur représente une distance de 10 μm. Barre d’échelle = 100 μm. Crédit d’image : Recherche Cerba
Figure 9. Boîte à moustaches pour la densité des Tregs (en haut) et des lymphocytes T (en bas) dans le stroma (bleu) et la tumeur (rouge) pour cinq échantillons de CRC. Crédit d’image : Recherche Cerba
Figure 10. Diagramme de zone montrant l’infiltration de Tregs (rouge) et de lymphocytes T (bleu) dans la tumeur (à gauche) à partir du stroma (à droite) pour cinq échantillons de CRC. Crédit d’image : Recherche Cerba
À propos de Cerba Research
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