Les systèmes CRISPR-Cas, des systèmes de défense des bactéries, sont devenus une source abondante de technologies pour le diagnostic moléculaire. Des chercheurs de l’Institut Helmholtz pour la recherche sur les infections à base d’ARN (HIRI) à Würzburg ont élargi cette vaste gamme d’outils. Leur nouvelle méthode, baptisée PUMA, permet de détecter l’ARN avec des nucléases Cas12, qui ciblent naturellement l’ADN. PUMA promet un large éventail d’applications et une grande précision. L’équipe a publié ses résultats dans la revue Nature Communications.
Les bactéries ont développé des mécanismes de défense spécifiques pour se protéger contre les virus, qui ne sont pas uniquement transmissibles aux humains. Dans le cadre de ces systèmes dits CRISPR-Cas, un acide ribonucléique CRISPR (crRNA), qui sert d'« ARN guide », reconnaît des régions d'un génome étranger, comme l'ADN viral.
La nucléase associée au CRISPR (Cas), dirigée par un ARNcr, le rend ensuite inoffensif en le coupant comme une paire de ciseaux. Les humains ont exploité cette stratégie : « CRISPR, souvent appelé « ciseaux génétiques », est la base de nombreuses technologies moléculaires », explique Chase Beisel, directeur du département de biologie synthétique de l'ARN à l'Institut Helmholtz pour la recherche sur les infections basées sur l'ARN (HIRI) à Würzburg. L'institut est un site du Centre Helmholtz de recherche sur les infections de Braunschweig (HZI) en coopération avec l'Université Julius-Maximilians (JMU) de Würzburg, où Beisel est professeur.
La plateforme de diagnostic LEOPARD, développée par le laboratoire de Beisel en coopération avec la JMU en 2021, exploite également la technologie CRISPR. LEOPARD a le potentiel de détecter une variété de biomarqueurs liés à la maladie en un seul test. L'approche est basée sur la reprogrammation de facteurs d'ARN, appelés tracrRNA. Ces ARN participent naturellement à la production d'ARN guides utilisés par Cas9 et différentes nucléases Cas12.
LEOPARD s'est concentré sur Cas9. Cependant, les systèmes CRISPR-Cas incluent également un autre ensemble diversifié de nucléases, appelé Cas12.
Chase Beisel, directeur du département de biologie synthétique de l'ARN à l'Institut Helmholtz pour la recherche sur les infections à base d'ARN (HIRI), Würzburg
Alors que Cas9 et Cas12 coupent tous deux des cibles d'ADN, Cas12 peut augmenter le signal de sortie en effectuant des coupes sur l'ADN « collatéral ». Cela peut rendre les technologies de détection plus sensibles et, par conséquent, plus efficaces.
L'équipe dirigée par Chase Beisel a maintenant étendu les fonctionnalités uniques de LEOPARD à Cas12. Les chercheurs ont nommé la méthode résultante PUMA (PtracrRNA programmables Tunlock protospacer-adjacent Mdétection indépendante de l'otif des ribonucléides UNcids par les nucléases Cas12). Les détails de leurs découvertes font l'objet d'un article dans la revue Nature Communications.
Surmonter les obstacles
Bien que les nucléases Cas12 soient largement utilisées dans les diagnostics moléculaires, deux limitations majeures persistent : les technologies basées sur Cas12 ont été limitées aux cibles ADN et à une séquence de reconnaissance spécifique appelée PAM, abréviation de motif adjacent au protoespaceurest nécessaire pour identifier la molécule cible.
PUMA relève ces défis avec élégance. Comme LEOPARD, cette nouvelle méthode s'appuie également sur les tracrARN. « Grâce à PUMA, nous pouvons reprogrammer les tracrARN. Cela nous permet de décider quel biomarqueur ARN devient un ARN guide. Cet ARN guide, à son tour, dirige Cas12 vers une molécule d'ADN que nous fournissons et active les ciseaux génétiques », explique le premier auteur de l'étude, Chunlei Jiao. Chunlei Jiao, ancien étudiant diplômé et chercheur postdoctoral au laboratoire de Beisel, a également participé au développement de LEOPARD. Il a récemment commencé à occuper un poste de professeur à l'Université nationale de Singapour. « La découpe de l'ADN nous indique ensuite quel biomarqueur était présent dans l'échantillon, comme les biomarqueurs spécifiques à différents agents pathogènes », ajoute Beisel.
La nouvelle méthode permet ainsi de détecter des biomarqueurs ARN à l’aide de nucléases CRISPR qui ne peuvent normalement reconnaître que l’ADN. « Cela est particulièrement important pour les biomarqueurs moléculaires qui ne peuvent être trouvés qu’au niveau de l’ARN. C’est le cas par exemple des virus à ARN », explique Beisel. Pourtant, PUMA ne nécessite pas de séquence de reconnaissance spécifique : le PAM est contenu dans la molécule cible d’ADN fournie. Comme les chercheurs fournissent la molécule cible, ils peuvent également introduire de l’ADN tronqué. Ils ont ainsi pu augmenter considérablement la vitesse de la méthode.
Plusieurs oiseaux, une pierre
« PUMA a le potentiel de devenir un outil flexible et précis pour la détection d’ARN », conclut Beisel. Enfin, l’équipe a démontré le potentiel de la méthode en identifiant cinq agents pathogènes bactériens associés à une septicémie aiguë. Leur détection s’appuyait sur un seul tracrRNA universel et reprogrammé, qui fournit un moyen simplifié de différencier les différents types de bactéries. Cela ouvre un large éventail d’applications potentielles en médecine : « La nouvelle technologie représente une nouvelle forme de diagnostic CRISPR qui permet des tests moléculaires fiables au point de service, que ce soit pour l’identification d’agents pathogènes viraux ou bactériens ou pour la détection de biomarqueurs du cancer », explique Jiao.
L'équipe de recherche planifie déjà ses prochaines étapes : « Notre objectif est d'obtenir une lecture multiplexée similaire à celle de LEOPARD et d'élargir la gamme d'applications de la technologie », explique Beisel, qui prévoit également une large utilisation dans la communauté des chercheurs : « Nous espérons que notre étude stimulera une exploration plus approfondie de la reprogrammation du tracrRNA. »
