En exploitant les outils de la biologie synthétique, les chercheurs turcs ont développé avec succès un de novo système riborégulateur pour détecter rapidement la présence du matériel génomique du coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère. Leur article est actuellement disponible sur medRxiv * serveur de pré-impression.
La pandémie actuelle de maladie à coronavirus (COVID-19) pose encore d'énormes défis aux sociétés du monde entier en raison d'un grand nombre d'individus infectés. En plus de cela, le SRAS-CoV-2 est connu pour perturber un large éventail de tissus dans le corps humain, entraînant parfois des maladies graves et potentiellement mortelles.
«Tester, tracer, isoler» représente une stratégie cruciale pour atténuer le risque de submerger le système de santé jusqu'à ce qu'une option thérapeutique viable soit trouvée. Par conséquent, des tests généralisés de COVID-19 sont indispensables pour arrêter la chaîne de transmission virale.
Le diagnostic moléculaire du COVID-19 repose fortement sur la PCR quantitative en temps réel qui identifie la présence d'acide ribonucléique SARS-CoV-2 dans le nasopharynx, la trachée ou les bronches; Néanmoins, la capacité de test ne parvient souvent pas à répondre à la demande croissante en raison des pénuries mondiales de réactifs.
De plus, les tests PCR en temps réel nécessitent généralement une installation de test adéquate et un personnel formé. Par conséquent, afin de compenser l'écart entre le rythme de l'infection et le nombre de tests, de nombreux organismes ont déclaré une utilisation d'urgence de in vitro produits de diagnostic pour le SRAS-CoV-2.
Schémas du principe de fonctionnement des biocapteurs toehold. b) Flux de travail pour la plate-forme de détection du SARS-CoV-2 sans cellule. Des sites cibles clés pour la détection du SRAS-CoV2 ont été identifiés sur le génome viral. Les déclencheurs Toehold sont ensuite générés à l'aide de NCBI Primer BLAST. Les candidats déclencheurs qui ont des prédictions d'énergie libre non optimales et les candidats qui ne sont pas compatibles avec l'amplification spécifique de l'espèce ont été éliminés. Les candidats éligibles ont ensuite été utilisés dans la conception de leurs interrupteurs respectifs in silico à l'aide du logiciel NUPACK ©. c) Validation des interrupteurs de pied conçus. Les déclencheurs ont été clones en aval du promoteur T7-LacO. Les commutateurs ont été clones en aval du promoteur T7-LacO et en amont du gène rapporteur sfGFP. Les deux constructions ont été transformées dans des cellules E. coli BL21 (DE3). Les cellules qui n'ont que le plasmide de commutation et les cellules qui ont à la fois des plasmides de commutation et de déclenchement ont été induites avec l'IPTG. d) Optimisation du système sans cellule. e) Développement de POC. Schémas de développement du lecteur optique électronique portable et économique.
Sommaire
La biologie synthétique à la rescousse
La biologie synthétique a été utilisée dans le passé pour élargir la portée des alternatives d'outils de diagnostic, parmi lesquelles les commutateurs de pied de riborégulateur polyvalents et programmables dominent en tant qu'option simple et peu coûteuse. Ils ont déjà été utilisés pour des virus pathogènes tels que Ebola et Zika, ainsi que pour l'évaluation de gènes de résistance aux antibiotiques.
En combinaison avec la technologie de transcription / traduction sans cellule (TXTL), des commutateurs de pied peuvent être utilisés pour la détection de séquences d'acide nucléique spécifiques dans des dispositifs de point de service, où le signal de sortie peut être une protéine fluorescente ou un produit de dégradation colorimétrique enzymatique .
De plus, la limite de détection des capteurs basés sur les orteils peut être augmentée en utilisant de simples réactions d'amplification isotherme, telles que l'amplification par recombinase polymérase ou l'amplification basée sur la séquence d'acide nucléique, avant la réaction TXTL.
C'est pourquoi des chercheurs de l'Université de Bilkent et de l'Université d'Ankara à Ankara, en Turquie, ont décidé de concevoir des interrupteurs spécifiques pour détecter la présence du génome du SRAS-CoV-2 et pour établir un projet de validation de principe.
Sélection de déclencheurs, construction de séquences de commutation
Plus spécifiquement, ces chercheurs ont sélectionné des régions spécifiques du génome du SRAS-CoV-2 – séquences codant ORF1ab, M, ORF678 et S – comme déclencheurs potentiels, car elles sont compatibles avec la réaction d'amplification basée sur la séquence d'acide nucléique.
Cela a été suivi par la construction et le test de séquences de commutation spécifiques aux déclencheurs qui contrôlent l'expression du variant de super repliement de la protéine fluorescente verte. Deux des quatre séquences de déclenchement (c'est-à-dire les régions trouvées dans les protéines ORF1ab et S) ont été identifiées avec des séquences de commutation conçues.
En bref, les mesures de fluorescence stipulaient que des déclencheurs sélectionnés à partir d'une région de la protéine S et de la séquence codant ORF1ab peuvent être utilisés pour activer la traduction réprimée par commutateur, et ont été en outre caractérisés dans une réaction TXTL sans cellule.
Reconnaissance rapide de l'interrupteur activé
Sur la base des résultats de cette étude, on peut dire que les chercheurs ont en effet développé avec succès un de novo système riborégulateur pour détecter la présence du matériel génomique du virus SARS-CoV-2.
Les deux paires déclencheur / interrupteur ont affiché des propriétés cinétiques similaires dans la réaction TXTL. Les réactions ont été saturées après 180 minutes lorsque la fluorescence totale est considérée; d'autre part, le circuit «commutateur seul» n'a pas donné un signal de fluorescence significatif.
Quelle est la découverte la plus significative pour obtenir des résultats rapides sur le terrain, un interrupteur activé pourrait être facilement distingué des contrôles inactivés et simulés même après 40 minutes de la période d'incubation.
Implémentation dans un dispositif au point de service
«En raison de leur capacité de prototypage rapide et de leur format facile à utiliser, l'interrupteur de pied dans le format de réaction TXTL est un excellent candidat pour développer un test avec», soulignent les auteurs de l'étude dans leur medRxiv papier.
« Un tel test peut être mis en œuvre dans un dispositif au point de service pour la surveillance du SRAS-CoV-2 dans des parties substantielles de la population, qui n'ont pas accès à une installation centralisée pour effectuer des tests de diagnostic sophistiqués tels que la PCR en temps réel ou ensuite -génération séquençage », ajoutent-ils.
Dans tous les cas, les biocapteurs basés sur les pieds qui sont mis en œuvre dans les dispositifs au point de service peuvent en effet faciliter la surveillance et le contrôle de la transmission du COVID-19 – en particulier dans les régions rurales et moins développées. Par conséquent, d'autres tests de caractérisation (qui se concentreront sur des échantillons cliniques) sont nécessaires pour développer un test complet en tant que nouvel ajout à notre arsenal de diagnostic.
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.
