Dans une étude récente publiée dans la revue Biotechnologie naturelleles chercheurs ont conçu des particules de type virus (eVLP) conçues par un éditeur principal (PE) délivrant des protéines PE, des acides ribonucléiques guides PE (pegARN) et des acides ribonucléiques guides uniques (ARNng) sous forme de complexes ribonucléoprotéiques (RNP).
Étude : Particules de type virus conçues pour la délivrance transitoire de complexes ribonucléoprotéiques principaux éditeurs in vivo. Crédit d’image : Andrii Yalanskyi/Shutterstock
Sommaire
Contexte : La promesse de Prime Editing
L’édition principale est une technologie prometteuse pour modifier l’acide désoxyribonucléique (ADN) génomique qui pourrait potentiellement être utilisée pour guérir les maladies génétiques chez les individus. Les éditeurs principaux sont des protéines qui peuvent remplacer une séquence spécifique d’acide désoxyribonucléique par une autre. Les systèmes PE nécessitent trois hybridations d’acides nucléiques distinctes et ne dépendent pas de cassures d’acide désoxyribonucléique double brin ou de modèles d’acide désoxyribonucléique donneurs.
Les chercheurs doivent concevoir des techniques efficaces et sûres pour fournir des éditeurs de premier ordre dans les tissus in vivo paramètres pour atteindre l’objectif de PE. Alors que les techniques de transmission virale telles que les adénovirus et les virus adéno-associés (AAV) peuvent transporter la PE in vivoles techniques de délivrance non virales telles que les nanoparticules lipidiques peuvent contourner ces problèmes en conditionnant les PE comme exprimant temporairement des acides ribonucléiques messagers.
Développement du système PE-eVLP
Dans la présente étude, les chercheurs ont développé un système VLP conçu par un éditeur principal pour fournir des éditeurs de premier ordre, notamment des ngRNA et des pegRNA sous forme de ribonucléoprotéines.
L’équipe a évalué le système PE-eVLP dans les cellules HEK293T, les cellules Neuro-2a et les cellules Gesicle Producer 293T pour des tests de culture cellulaire. Les chercheurs ont créé des PE-eVLP v3 et v3b avec une efficacité d’édition 65 à 170 fois supérieure dans les cellules humaines par rapport à une conception eVLP d’éditeur de base précédemment rapportée. Ils ont utilisé des eVLP v1.2 prime editor avec des acides ribonucléiques guides PE (epegRNA) et ont remplacé la protéine PE par PEmax2.
Optimiser pour l’efficacité : les PE-eVLP v1.2 et v2.3
L’équipe a utilisé des PE-eVLP v1.2 avec des pegRNA modifiés pour remplacer la protéine principale de l’éditeur par PEmax2, un PE amélioré qui inclut des substitutions d’acides aminés SpCas9, une molécule de liaison optimisée entre le domaine RT, la nickase Cas9 et l’optimisation du signal de localisation nucléaire (NLS). , et l’optimisation des codons. Ils ont cherché à identifier les goulots d’étranglement mécanistiques dans les PE-eVLP v1, en résolvant le problème en déplaçant les signaux d’exportation nucléaire (NES) au sein de la protéine Gag et en insérant trois signaux d’exportation nucléaire avant le site de clivage de la protéase de chaque sous-domaine de la protéine Gag avec deux régions supplémentaires qui pourrait tolérer de grandes insertions dans le MMLV Gag-Pol.
Les chercheurs ont observé que les voies de réparation des mésappariements cellulaires (MMR) peuvent réduire l’efficacité de l’EP et qu’éviter ou inhiber le MMR améliore l’efficacité de l’EP. Pour étudier ce potentiel pour les systèmes d’édition primaires fournis par eVLP, ils ont utilisé le système v2.3 prime editor-eVLP pour insérer des modifications rapprochées supplémentaires aux loci HEK3 et Dnmt1.
Les chercheurs ont étudié si l’ARNng pouvait être emballé dans la même particule ou dans une particule différente de l’epegRNA pour trouver le meilleur système tout-en-un de particules v3 PE3-eVLP. Ils ont également examiné si ces changements amélioraient la délivrance de BE médiée par eVLP. L’introduction transitoire de PE via eVLP a réduit la capacité des PE-eVLP v3 et v3b à faciliter l’édition principale in vivo dans le système nerveux central de la souris.
Résultats : progrès de la technologie PE-eVLP
La recherche vise à créer des PE-eVLP de troisième génération avec des niveaux cliniquement pertinents d’édition primaire dans la rétine, de restauration de l’expression des protéines et de sauvetage partiel de la fonction visuelle. Les chercheurs ont trouvé et conçu des éditeurs de premier ordre et des architectures VLP conçues, ce qui a entraîné une augmentation de l’efficacité PE de 79 fois dans les cellules murines de type neuro-2A (N2A) et une amélioration de 170 fois dans les cellules HEK293T humaines par rapport aux PE-eVLP v1. . Une injection sous-rétinienne v3 PE-eVLP a corrigé une délétion Mfrp de 4,0 pb dans le modèle de dégénérescence rétinienne murine rd6 (efficacité moyenne de 15 %) et une mutation Rpe65 pour libérer partiellement les fonctions visuelles dans le modèle rd12 (efficacité moyenne de 7,2 %).
Innovations clés dans la conception PE-eVLP
Les signaux d’exportation nucléaire favorisent la localisation de la protéine Gag-cargo dans le cytoplasme, et les p = quatre régions supplémentaires de clivage de la protéase MMLV dans la protéine Gag augmentent la possibilité de clivage incomplet, conduisant à la conservation de certains signaux Gag et d’exportation nucléaire par la cargaison PE. Dans les cellules 293T du rein embryonnaire humain, l’insertion de trois signaux d’exportation nucléaire entre les domaines CA et p12 de Gag (position du signal d’exportation nucléaire numéro 5) a entraîné l’efficacité PE la plus élevée, générant l’éditeur principal-eVLP v2.2.
Les chercheurs ont utilisé la technique v2.3 prime editor-eVLP pour insérer des remplacements adjacents supplémentaires au niveau du rein embryonnaire humain (HEK3) et des locus Dnmt1, ce qui a amélioré l’efficacité de l’édition primaire dans les deux cas. Un emballage inadéquat d’epegRNA a entravé l’efficacité du PE-eVLP, alors que la supplémentation en epegRNA a augmenté de plus de 8,0 fois l’efficacité de l’édition des VLP conçues par PE. Avec les PE3-eVLP v3, les chercheurs ont obtenu une édition globale du cortex de 2,3 % et une édition de 36 % parmi les noyaux GFP+.
Conclusion : orientations futures pour les PE-eVLP
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que les PE-eVLP optimisés permettent une administration transitoire in vivo de ribonucléoprotéines principales éditrices, améliorant ainsi la sécurité et inhibant l’intégration du transgène oncogène. En culture et in vivo, ces particules ressemblant à des virus transportent les RNP PE dans les cellules de mammifères. Les progrès récents dans les systèmes d’édition primaires, notamment les epegRNA, la conception PEmax et l’évitement du MMR, ont abouti à de meilleurs résultats. In vivo, les systèmes PE-eVLP v3 et v3b améliorés ont corrigé les délétions pathogènes dans la rétine de la souris et atteint des niveaux d’édition équivalents aux systèmes AAV-PE à triple vecteur dans les modèles de cécité génétique. Les PE de nouvelle génération et les systèmes eVLP améliorés nécessiteront des travaux techniques supplémentaires.
