Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont exploré la structure cristalline du virus du monkeypox (MPX) (MPXV) et le complexe de VP39, une 2′-O-ARN méthyltransférase (MTase) et de la sinefungine, un inhibiteur de pan-MTase.
Le nombre de cas de MPX augmente d’heure en heure dans le monde et pourrait indiquer une nouvelle pandémie. L’analyse structurale du MPXV pourrait aider au développement d’agents antiviraux efficaces pour combattre le MPXV. Les poxvirus codent pour des enzymes de type décoiffant pour empêcher l’accumulation d’acide ribonucléique double brin (ARNdb) pendant l’infection qui pourrait induire des réponses immunitaires antivirales innées. MPXV code pour l’enzyme poxine qui inhibe la voie cGAS-STING (Cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes) déclenchée par l’acide ds désoxyribonucléique (dsDNA).
La méthylation du nucléotide initial (nt) de la coiffe MPXV mature (ou cap-1) à l’emplacement 2′-O ribose a été documentée. La MTase est requise par la famille des virus poxviridies (y compris MPXV) pour la synthèse de cap-0 et en ajoutant un autre groupe méthyle à l’emplacement 2′-O du ribose proximal, la coiffe immature (cap-0) peut être convertie en mature casquette. Cette étape est essentielle pour prévenir le développement de réponses immunitaires innées et est catalysée par VP39, la 2′-O MTase du MPXV.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont évalué la structure complexe VP39-sinefungine du MPXV pour améliorer la compréhension des mécanismes d’inhibition de la molécule VP39 par la sinefungine. Ils ont également comparé la structure aux 2′-O MTases des virus à ARN simple brin (ssRNA) tels que le virus Zika et le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2).
Le gène VP39 de la souche MPXV USA-May22 a été optimisé en codons pour être exprimé dans E. coli pour une synthèse et un clonage ultérieurs. Des cellules E. coli BL21 ont été converties avec le plasmide exprimant VP39 et de l’IPTG (isopropyl-bD-thiogalactopyranoside) a été ajouté, après quoi le VP39 recombinant a été purifié. Les cellules ont été centrifugées, lysées et le lysat a été soumis à une analyse chromatographique. VP39 a été concentré et mélangé avec de la sinefungine pour des essais basés sur la cristallisation.
Les cristaux initialement formés ont été broyés et des écrans d’ensemencement et des substrats d’ARN ont été préparés par transcription in vitro. Par la suite, des dosages de 2´-O-MTase et des analyses de spectrométrie de masse par écho ont été effectués. Le taux d’activité de la MTase, l’inhibition de la 2´-O-MTase par la sinefungine et les taux de conversion du substrat (SAM) ont été déterminés, et la concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) les valeurs ont été déterminées.
L’ensemble de données cristallographiques des cristaux de diffraction obtenus a été analysé. Les caractéristiques structurelles du complexe VP39/sinefungine ont été étudiées en utilisant la méthode de substitution moléculaire avec la structure du complexe VP39/SAH du virus de la vaccine comme modèle de recherche. Pour vérifier l’activité enzymatique de VP39 recombinant, deux substrats avec des avant-dernières bases différentes (m7GpppA-ARN et m7GpppG-ARN) ont été testés.
Les interactions VP39-sinefungine ont été analysées en construisant un modèle du complexe sinefungine:ARN:VP39 pour illustrer les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’inhibition de VP39 par la sinefungine. De plus, les sites catalytiques VP39 ont été comparés à ceux des 2′-O-ribose MTases des virus Zika distants et du SARS-CoV-2.
Résultats
La structure MPX comprenait un pli de Rossman ressemblant à un pliage alpha/bêta (α/β), avec la feuille β située au centre comprenant β2-β10 dans un motif ressemblant à la lettre J. Notamment, le schéma a également été trouvé pour la protéine non structurelle 2′-O MTase (nsp) 1614 du SRAS-CoV-2. La feuille β centrale était fixée en place à une extrémité par les hélices alpha-1, alpha2, alpha-6 et alpha-7 et par les hélices alpha-3 et alpha-7 à l’autre extrémité, et les côtés étaient reliés par β1, β11 et α5.
Les deux substrats RNAS se sont révélés acceptables; cependant, celui avec une avant-dernière base de guanine était préférable. La sinefungine a inhibé VP39 avec un IC50 valeur de 41 µM. La sinefungine s’est avérée occuper la poche SAM avec sa fraction de base adénine située dans un canyon profondément situé bordé de chaînes latérales de type hydrophobe des résidus Val116, Phe115, Leu159 et Val139 avec une liaison hydrogène. La sinefungine protégeait efficacement la région 2′-O-ribose avec ses groupes amino près de la région 2′ ribose où l’atome de soufre de SAM serait autrement situé.
Le canyon SAM avait deux extrémités, dont une extrémité bordant la poche d’ARN était vitale pour positionner SAM pour les réactions de la méthyltransférase, et l’extrémité opposée située à côté de la base adénine de la sinefungine était inoccupée. En y regardant de plus près, l’emplacement a montré un réseau complexe de molécules d’eau reliées par une liaison hydrogène et liées aux résidus Glu118, Asn156 et Val116 et à la fraction adénine.
Les molécules à base d’échafaudage de sinefungine portant des fragments qui pourraient déplacer les molécules d’eau et interagir directement avec les résidus Glu118, Asn156 et Val116 pourraient être des liants exceptionnellement bons puisque le déplacement des molécules d’eau pourrait provoquer des effets entropiques favorables. La ressemblance du site de liaison MPXV SAM avec Zika et SARS-CoV-2 était remarquable. Des conformations identiques ont été observées entre la sinefungine et les protéines NS5, nsp16 et VP39 de Zika, SARS-CoV-2 et MPXV, respectivement.
La tétrade de résidus catalytiques (Asp138, Lys41, Glu218 et Lys175) pour MPXV a été conservée parmi les trois virus distants testés, y compris les conformations de résidus. De plus, tous les virus utilisaient un résidu aspartate pour interagir avec le groupe amino de la sinefungine. Les modes de liaison conservés parmi les trois virus ont indiqué qu’un seul inhibiteur de MTase pourrait être potentiellement utilisé comme agent pan-antiviral. Cependant, des différences ont été observées dans les modes de liaison du cycle nucléobase et ribose.
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que les inhibiteurs à base de MTase pourraient être des cibles pan-antivirales.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
