Dans une récente étude publiée sur bioRxiv*, les chercheurs ont évalué la cinétique de réplication précoce du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2).
Sommaire
Arrière plan
La réplication du SRAS-CoV-2 commence par l’entrée cellulaire et la libération d’ARN viral dans le cytoplasme. L’ARN génomique à brin positif (ARNg) sert de matrice pour traduire les protéines virales et générer des intermédiaires de réplication à brin négatif. Cet ARN à brin négatif est, à son tour, une matrice pour synthétiser de l’ARN à brin positif supplémentaire et des ARN sous-génomiques plus courts (ARNsg).
Le SRAS-CoV-2 modifie la membrane du réticulum endoplasmique (RE) de l’hôte pour synthétiser les organites de réplication (RO), des vésicules à double membrane renfermant des ARN viraux. Plusieurs questions liées à la réplication précoce du SRAS-CoV-2 restent sans réponse, notamment le temps nécessaire pour terminer la traduction de l’ARN viral, initier la réplication et synthétiser les gARN et les sgARN.
L’étude et les conclusions
La présente étude a exécuté une analyse de cours de temps pour évaluer la cinétique de réplication SARS-CoV-2. Tout d’abord, les chercheurs ont utilisé une fluorescence d’ARN à molécule unique sur place technique d’hybridation (smRNA-FISH) pour détecter l’ARNg viral et l’ARNsg au niveau d’une seule cellule et d’une seule molécule. Ainsi, 40 oligonucléotides antisens marqués par fluorescence ont été développés sur la base de la séquence du gène de pointe.
Les auteurs ont déterminé que les oligonucléotides étaient spécifiques du SRAS-CoV-2. Ensuite, les cellules Vero E6 ont été infectées avec < 0,5 multiplicité d'infection (MOI) de SARS-CoV-2 et soumises à smRNA-FISH avec une sonde sgRNA-spike (P1). Les cellules ont été analysées indépendamment, en tant que contrôle positif, par immunofluorescence pour détecter l'expression de la nucléocapside virale (N) à l'aide d'anticorps α-N.
Les sondes et les anticorps α-N ont respectivement détecté l’ARN viral et la protéine N dans les cellules infectées mais pas dans les cellules non infectées. De plus, les cellules Vero E6 ont été infectées par le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) contenant une séquence optimisée en codons de cadre de lecture ouvert (ORF) de pointe comme contrôle négatif. La sonde P1 n’a pas réussi à détecter la pointe du VSV dans les cellules infectées, ce qui implique que les sondes étaient spécifiques à la séquence du gène SARS-CoV-2 de type sauvage.
Les cellules infectées par le SRAS-CoV-2 ont été soumises à l’ARNsm-FISH et visualisées à un grossissement de 20x à l’aide d’une microscopie à fluorescence à balayage haute résolution à grande vitesse (HSHRS-FM). Les auteurs ont observé de petites plaques caractérisées par des grappes de cellules fluorescentes positives à la sonde autour des cellules mortes, indiquant que la sonde était sélective pour l’ARN viral dans les cellules infectées vivantes.
En outre, les chercheurs ont effectué une analyse de l’évolution temporelle commençant à 0,5 heure après l’infection (hpi). Les cellules ont été infectées avec 0,5 MOI de SARS-CoV-2 pour empêcher plusieurs particules virales de pénétrer dans la même cellule. Les cellules infectées ont été visualisées à l’aide de HSHRS-FM à un grossissement de 20x pour quantifier la proportion de cellules infectées. Environ 7 % des cellules étaient infectées à 6 hpi, 23 % à 12 hpi et plus de 50 % à 24 hpi, suggérant une réplication retardée au début.
De plus, ces cellules ont été visualisées à l’aide d’un microscope à fluorescence avec une lentille grand angle à un grossissement plus élevé (60x) et un objectif d’huile à ouverture numérique de 1,4, permettant la détection de molécules uniques d’ARN du SRAS-CoV-2 dans les cellules infectées. À 0, 5 et 2 hpi, des molécules uniques d’ARN étaient visibles dans les cellules infectées mais pas dans les cellules non infectées, qui n’étaient pas identifiées à des grossissements inférieurs à ces moments.
À 6 hpi, des taches représentant des molécules uniques et des taches plus grandes d’ARN multiples étaient évidentes. À 12 hpi, l’ARN du SRAS-CoV-2 a rempli tout le cytoplasme. Ensuite, les auteurs ont évalué la capacité d’une autre sonde (P2) dérivée de la protéine non structurale 12 (nsp12) des séquences de gènes pour détecter l’ARNg seul puisque P1 pouvait détecter à la fois l’ARNg et l’ARNg.
L’analyse de l’évolution temporelle a été répétée en utilisant les sondes P1 et P2 ensemble. À un grossissement plus élevé (76x), la plupart des cellules à 2 hpi et 3 hpi ont montré des taches d’ARN uniques positives pour les sondes P1 et P2. À 3 hpi, la tache d’ARN unique dans certaines cellules semblait abriter à la fois des ARNg et des ARNsg.
Au même moment, les auteurs ont observé une région centrale positive pour les sondes P1 et P2, entourée de spots P1-positifs, ce qui implique que le centre du cluster abritait probablement de l’ARNg et que la périphérie contenait de l’ARNsg. Cela a suggéré que les grappes d’ARN étaient des RO induits par le SRAS-CoV-2 à 2 et 3 hpi.
D’autres examens microscopiques ont suggéré que les points positifs individuels à <2 hpi étaient probablement des ARNg uniques dans chaque cellule. À des moments ultérieurs, les taches plus grandes représentaient des RO avec gRNA et sgRNA au centre et à la périphérie, respectivement. Cela a été suivi par la formation de plusieurs RO filles à des moments ultérieurs.
De plus, les auteurs ont observé une hétérogénéité substantielle dans l’apparition de l’ARN dans les cellules infectées. La plupart des cellules infectées avaient initialement un ou quelques RO par cellule, qui augmentaient avec le temps et remplissaient tout le cytoplasme. Les images obtenues avec la sonde P2 ont été utilisées pour quantifier la progression de la réplication de l’ARN puisque la sonde s’hybride à l’ARNg seul. Les étapes de réplication ont été arbitrairement définies des étapes 1 à 4.
L’étape 1 a été définie comme un à cinq mouchetures RO par cellule. Les stades 2 et 3 étaient intermédiaires avec l’augmentation progressive des RO. Le stade 4 était le stade tardif, les RO remplissant tout le cytoplasme. À 4 hpi, environ 35 % des cellules infectées ont montré une réplication du SRAS-CoV-2 aux stades 1 à 3, avec 2,5 % des cellules au stade 4. La proportion de cellules avec une réplication virale de stade 4 a augmenté avec le temps, avec 51 % des cellules à 6 hpi.
conclusion
En résumé, l’étude a fourni des informations sur la cinétique de réplication du SRAS-CoV-2 à des moments précoces à une résolution unicellulaire et moléculaire et a illustré comment les RO se forment et progressent à partir d’un seul ARN.
Le taux de réplication de l’ARN était hétérogène d’une cellule à l’autre, car la nature et le nombre de RO étaient différents dans les cellules. Les résultats ont révélé que des ARNg simples pouvaient être visualisés dans les 30 minutes suivant l’infection, et que des RO peuvent apparaître dans les 2 hpi, progressant rapidement et remplissant le cytoplasme à des moments ultérieurs.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies
