Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) interagit avec les récepteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) à la surface des cellules hôtes via le domaine de liaison au récepteur (RBD) de la protéine de pointe du virus.
La structure de la protéine de pointe et ses domaines ont été catalogués depuis le début de la pandémie, et cette information s’est avérée vitale dans le développement de procédures de diagnostic et de vaccins. Cependant, les caractéristiques structurelles spécifiques et le profil des glycanes de surface dépendent fortement des conditions de synthèse. Ceux qui sont produits par voie biotechnologique sont susceptibles de différer de leur forme naturelle.
Un document de recherche récemment téléchargé sur le serveur de pré-impression bioRxiv * par Dominguez-Vega et al. (23rd Février 2021) décrit une analyse structurelle approfondie de la RBD de la protéine de pointe exprimée dans les cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO) et les cellules de rein embryonnaire humain (HEK293), fournissant une nouvelle compréhension de la structure et de la fonction des protéines.
Pourquoi est-ce important?
Des protéines de pointe recombinantes ont été précédemment produites sous des formes complètes et courtes pour développer des anticorps neutralisants et des vaccins par plusieurs voies, y compris par des cellules rénales embryonnaires humaines. Lors de leur production, cependant, il a été noté que ces protéines portaient des structures de glycane différentes, ce qui pourrait potentiellement modifier la façon dont la protéine de pointe et la RBD interagissent avec l’ACE2 et les anticorps. Plusieurs chercheurs ont noté que les protéines de pointe produites de manière recombinante peuvent différer en fonction de leur source, de la longueur de la protéine exprimée et de toute modification post-traductionnelle qui peut avoir lieu. Une réplication minutieuse de la véritable protéine de pointe est essentielle pour un vaccin efficace et la création d’anticorps neutralisants.
Caractérisation multi-niveaux des RBD produits dans les cellules HEK293 ou CHO À côté de l’analyse des protéines intactes en utilisant CE-MS et MALDI-ISD-MS, les échantillons sont structurellement caractérisés par dissection de glycane, analyse de glycopeptide et analyse de glycane libéré. Leur caractérisation fonctionnelle a été réalisée en mesurant leurs caractéristiques de liaison aux anticorps ACE2 et anti-SARS-CoV-2.
En quoi les RBD différaient-ils?
Le groupe a effectué une analyse structurelle approfondie de deux RBD recombinantes disponibles dans le commerce produites par des cellules CHO et HEK293, en commençant par l’électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse (CE-MS) après déglycosylation de la RBD pour établir les séquences protéiques et toute différence de masse entre les RBD sans prendre en compte les glycanes. Celles produites à la fois par les cellules CHO et HEK293 étaient en moyenne de 119 Da plus grandes que la masse théorique de la protéine, expliquée par la présence d’un acide aminé cystéine libre qui devient cystéinylé pendant la production d’anticorps.
La spectrométrie de masse par désorption laser assistée par matrice ionisation dans la désintégration de la source (MALDI-ISD), qui est souvent utilisée pour fragmenter les protéines en ions directement dans la source d’ions, a été réalisée, et il a été constaté que les cellules HEK293 avaient plus de différences par rapport aux dans le nombre et le type de protéines N-terminales. L’acide pyroglutamique se forme à partir des résidus d’acide glutamique et 52% de la séquence se sont révélés affectés de cette manière. Les cellules HEK293 ont une séquence légèrement différente qui entraîne un supplément de glutamine à l’extrémité N-terminale après le clivage, expliquant le déplacement de masse de 111 Da par rapport au CHO RBD après prise en compte de la formation d’acide pyroglutamique.
Les N-glycanes et les O-glycanes ont été individuellement libérés et analysés par CE-MS et MALDI-ISD MS. HEK293 avait une plus grande hétérogénéité, et plus de glycanes étaient sialylés, beaucoup de ceux étant di- ou tri-sialylés, ce qui affecte le point isoélectrique de la protéine.
Des dosages de liaison d’anticorps ont été réalisés avec les RBD glycosylés et non glycosylés contre les anticorps IgG anti-SARS-CoV-2 collectés à partir de sérums de patients et le récepteur ACE2. Les deux RBD ont donné des résultats similaires dans chaque cas. Les RBD non glycosylés présentant une affinité réduite de moitié envers le récepteur ACE2, comme prévu d’après les rapports précédents et théorisés comme étant dus à la stabilité conformationnelle fournie au RBD par les glycanes. L’affinité de l’un ou l’autre RBD envers ACE2 était supérieure à celle de la protéine de pointe complète ou de la sous-unité contenant la RBD, très probablement en raison d’une diminution de l’encombrement stérique autour du site de liaison et donc d’un meilleur accès au récepteur.
Dans l’ensemble, les cellules CHO étaient moins sialylées mais portaient des structures de répétition plus antennaires et LacNAc, tandis que les cellules HEK293 avaient une sialylation et une fucosylation d’antenne plus élevées. De plus, le groupe a découvert un nouveau site de O-glycosylation qui n’est pas présent dans la protéine de pointe de forme complète et pourrait avoir des implications dans la liaison au récepteur.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas examinés par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
