Dans cette interview, Ma Clinique s’entretient avec Ben Capozzoli sur la meilleure façon de préparer des échantillons de noyaux avant les flux de travail de séquençage de cellules uniques et d’optimiser l’extraction des noyaux.
Sommaire
De quels tissus peut-on extraire les noyaux ?
Les extractions de noyaux s’adaptent à une grande variété de types de tissus et de méthodes de conservation. Nous avons demandé à des chercheurs d’utiliser des tissus de mammifères provenant de souris, de rats, d’humains et d’autres, conservés par congélation instantanée, OCT et FFPE, ainsi que de les extraire directement de tissus frais.
L’un des principaux avantages de l’extraction de noyaux pour le séquençage est que la méthode s’adapte mieux à différentes méthodes de conservation qui rendraient impossible l’extraction de cellules viables, comme la congélation des tissus ou leur conservation en OCT ou FFPE. Par conséquent, les échantillons mis en banque provenant d’années de collecte peuvent être analysés simultanément grâce au séquençage d’un seul noyau.
De même, les suspensions de cellules uniques qui sont relativement faciles à générer à partir de tissus de mammifères ne sont tout simplement pas réalisables dans les tissus végétaux en raison de la présence de la paroi cellulaire. Pour cette raison, les chercheurs qui souhaitent séquencer les tissus végétaux au niveau d’une seule cellule ne peuvent recourir qu’à des isolements de noyaux pour obtenir un résultat.
Comment les clients peuvent-ils optimiser l’extraction des noyaux ?
Les noyaux peuvent être extraits de plusieurs manières. Par exemple, nous avons utilisé le tampon d’extraction Miltenyi et le système gentleMACS™, qui automatise le processus de broyage. C’est un excellent système pour traiter plusieurs échantillons simultanément et garantir que tous les échantillons sont traités de la même manière.
Un autre kit que nous avons utilisé est le kit 10x Genomics, qui implique un broyage manuel mais reste un excellent système d’extraction. Nous avons également utilisé avec succès des options de tampons formulées par l’utilisateur pour une variété de types et d’espèces de tissus différents.
L’une des considérations les plus importantes dans le flux de travail des noyaux est de garder tout au froid. La membrane cellulaire protège généralement les noyaux, mais ceux-ci deviennent plus fragiles lorsqu’ils sont isolés. Cela signifie que nous devons agir rapidement et garder tout au froid pour ralentir ou empêcher la lyse osmotique des noyaux, car nous voulons qu’autant de noyaux que possible parviennent à l’étape de séquençage.
Mon conseil est de tout préparer à l’avance. Les dilutions doivent être effectuées à l’avance. Les tampons doivent être refroidis ou réchauffés à leurs températures appropriées pour garantir qu’il n’y ait pas de temps d’attente, car cela affecterait l’efficacité de l’extraction. Ces informations peuvent être trouvées dans les instructions du kit.
Enfin, des étapes de filtration seront nécessaires pour éliminer autant de débris cellulaires que possible. Différents tissus peuvent nécessiter des tailles de filtre différentes.
Quelle est la meilleure façon de préparer les échantillons de noyaux extraits pour l’analyse de contrôle qualité ?
La première étape consiste à équilibrer les colorants d’acide nucléique fluorescents orange d’acridine et iodure de propidium (AO/PI) à température ambiante. La suspension de noyaux doit être conservée sur la glace pour garantir qu’elle reste stable, mais le test AO/PI doit être à température ambiante pour éviter la perte de signal.
Une fois que l’AO/PI est à température ambiante pendant quelques minutes, vous pouvez marquer la suspension de noyaux avec. Aucun temps d’incubation n’est requis pour AO/PI. Après avoir mélangé votre suspension un à un avec AO/PI, vous pouvez la charger sur le CellDrop. L’échantillon doit être soigneusement mélangé immédiatement avant le chargement afin que tout soit remis en suspension avant de compter sur le CellDrop.
Crédit d’image : DeNovix
La combinaison de l’AO/PI et du signal fluorescent des deux colorants élimine beaucoup de subjectivité du comptage et offre une précision supérieure par rapport à la méthode traditionnelle d’utilisation du bleu trypan.
Qu’est-ce que le DeNovix CellDrop et quelles fonctionnalités clés le rendent optimal pour le comptage cellulaire ?
Le CellDrop est une méthode de quantification de noyaux précise et fiable. Il s’agit d’un compteur de cellules automatisé basé sur l’image, ne nécessitant aucun consommable, et il est excellent pour le contrôle qualité de ce flux de travail d’extraction. Le CellDrop tire parti des marqueurs fluorescents AO/PI et fournit à chaque fois un comptage de noyaux rapide, fiable et précis. L’instrument dispose d’un écran tactile haute définition pour visualiser les échantillons et les données et peut également se connecter au Wi-Fi et à Ethernet pour l’exportation de données.
La technologie brevetée DirectPipette™ de CellDrop ne nécessite aucune lame en plastique, ce qui est idéal pour les initiatives écologiques, le budget et l’aspect pratique. La technologie DirectPipette™ offre également des avantages en termes de performances car le CellDrop utilise des surfaces en saphir de précision très plates et une vis moteur de haute précision pour contrôler la hauteur du bras. Pour cette raison, il y a moins de variabilité dans les mesures CellDrop qu’avec les lames en plastique ou les hémocytomètres traditionnels. Les surfaces en saphir permettent également une optique incroyablement claire.
De nombreuses fonctionnalités incluses dans le logiciel permettent au CellDrop de s’intégrer parfaitement dans un flux de travail de laboratoire établi. Le protocole de comptage est un outil majeur pour standardiser le comptage dans l’ensemble du laboratoire. Le CellDrop offre une variété de paramètres qui peuvent être réglés d’un échantillon à l’autre pour permettre une précision accrue pour chaque flux de travail expérimental.
Une fois que vous avez personnalisé le protocole, vous pouvez utiliser un très petit volume de votre isolation globale de noyaux et en économiser autant que possible pour vos applications en aval. Ces paramètres sont faciles à définir, à enregistrer et à recharger, ce qui augmente la précision dans tout le laboratoire en permettant à chacun d’utiliser les mêmes paramètres de comptage.
Notre équipe d’applications est heureuse de travailler avec les chercheurs pour générer des protocoles pour leur type d’échantillon spécifique. Nous pouvons fournir des conseils, optimiser les protocoles et garantir que l’analyse du contrôle qualité de leurs noyaux est aussi efficace que possible.
Quels avantages votre méthode d’imagerie et de comptage des noyaux présente-t-elle par rapport aux méthodes traditionnelles ?
Traditionnellement, le bleu trypan colorait les cellules mortes parce que leurs membranes cellulaires compromises permettent au gros colorant de passer dans la cellule. Toutefois, lorsque l’on travaille avec des noyaux, cette membrane cellulaire est retirée lors de l’isolement. Cela signifie que le bleu trypan colorera tous les noyaux isolés en noir et que le colorant sera exclu par les cellules vivantes. La microscopie à fond clair serait ensuite utilisée pour compter les noyaux.
Il s’agit d’un excellent outil d’analyse depuis longtemps et fonctionne bien dans les échantillons de cultures de tissus propres. Cependant, le bleu trypan cristallise avec le temps. Si votre trypan n’est pas propre, vous pourriez vous retrouver avec des débris qui gaspilleront votre précieux volume de noyaux et perturberont votre analyse.
Un autre problème, lorsqu’il s’agit d’échantillons de sang, est que le bleu trypan ne peut pas distinguer les cellules vivantes des globules rouges, que nous ne voulons généralement pas compter. Les débris apparaîtront également sombres et ressembleront à une cellule morte, ajoutant encore plus de confusion. Ce sont tous des défis présentés par le comptage au bleu trypan qui rendent la méthode plus subjective que la fluorescence.
Nous recommandons à nos clients d’utiliser AO/PI pour compter les noyaux. L’acridine orange (AO) et l’iodure de propidium (PI) sont des colorants d’acide nucléique fluorescents. L’AO est activement transportée dans les cellules vivantes et émet une fluorescence verte. Le PI se comporte de manière similaire au bleu trypan dans la mesure où les cellules vivantes excluent le colorant en raison de sa grande taille, mais les cellules dont la membrane cellulaire est compromise et en cours d’apoptose incluent le colorant dans le noyau et émettent une fluorescence rouge.
Les deux taches nécessitent la liaison d’un acide nucléique pour devenir fluorescentes. Étant donné que le processus d’isolation des noyaux enlève la membrane cellulaire, tout noyau extrait d’une cellule doit s’allumer en rouge à partir du PI, et toute cellule qui n’a pas été correctement lysée lors de notre extraction se colorera en vert. Les objets qui n’ont pas de noyau, comme un globule rouge ou tout débris laissé par votre extraction, ne sont pas fluorescents.
La fluorescence est un outil d’analyse très puissant qui élimine une grande partie de la subjectivité du processus en transformant essentiellement le processus de comptage en un choix binaire de rouge ou de vert.
Crédit d’image : D. Kucharski K. Kucharska/Shutterstock.com
Comment CellDrop aide-t-il les clients à réussir dans leurs applications en aval ?
Le processus de comptage CellDrop est rapide et efficace, permettant aux utilisateurs de vérifier rapidement la qualité et la quantité d’un échantillon avant de passer aux applications en aval. Nos clients ont utilisé cette technologie sur différents protocoles d’isolement de noyaux, en utilisant des échantillons tels que des reins frais, des reins congelés, des poumons congelés, des racines de tomates fraîches et des cerveaux de souris congelés.
L’une des fonctionnalités intéressantes du CellDrop est qu’il vous permet d’analyser visuellement les débris en temps réel. Cela vous permettra de déterminer rapidement si vous avez besoin d’une filtration ou d’une purification supplémentaire avant de passer à la préparation de la bibliothèque. Si le niveau de débris est trop élevé pour passer à la préparation de la bibliothèque, vous pouvez utiliser un kit de purification pour purifier les noyaux. Comme CellDrop nécessite très peu de volume d’échantillon, une nouvelle vérification après purification est également possible.
Une fois que vos échantillons isolés répondent aux critères de contrôle qualité, vous pouvez passer à des applications en aval, telles que le séquençage d’ARN, le séquençage ATAC ou la cytométrie en flux.
Ces applications en aval nécessitent toutes un échantillon contenant beaucoup de noyaux, très peu de débris et peu de cellules intactes. Grâce au CellDrop, vous connaîtrez la concentration exacte de vos noyaux, le niveau de débris et le nombre de cellules intactes dans votre échantillon. Cela garantit que vous disposez d’un échantillon de haute qualité qui seraJ’espère que vous donnerez de bons résultats lorsque vous les chargerez dans vos applications en aval.
Pouvez-vous résumer pourquoi vos clients bénéficient du CellDrop ?
Les extractions de noyaux sont des procédures longues, sensibles et coûteuses. Les extractions nécessitent beaucoup d’équipements coûteux, et il s’agit simplement d’isoler les noyaux, et non de traiter ces noyaux avec RNA-seq ou Assay for Transposase-Accessible Chromatin using séquençage (ATAC-Seq).
Vous avez besoin d’échantillons de haute qualité avant de pouvoir réaliser l’une de ces expériences coûteuses. Le contrôle de la qualité des échantillons est donc un élément essentiel du processus. Le contrôle qualité vous aidera à garantir que vous ne gaspillez pas d’argent sur un échantillon qui n’a pas bien été extrait ou qui présentait un autre problème qui pourrait être facilement visualisé par comptage.
Grâce au comptage basé sur l’image sur CellDrop, nous pouvons contrôler la qualité de manière reproductible de tous vos échantillons de noyaux d’une manière facile à interpréter, puissante et vous permettant de prendre des décisions rapides avant de poursuivre votre expérience.
Où nos lecteurs peuvent-ils trouver plus d’informations ?
Veuillez visiter denovix.com pour des ressources supplémentaires. Une série de livres électroniques et de webinaires couvrent les méthodes de comptage et les protocoles de comptage sur CellDrop, et il existe des notes techniques pour différentes applications, y compris les applications d’isolation de noyaux.
J’encourage les chercheurs à planifier une démonstration virtuelle ou un essai gratuit avec un membre de l’équipe scientifique des applications pour découvrir comment CellDrop peut améliorer leur flux de travail de préparation de noyaux.
DeNovix propose également un programme d’essai gratuit aux États-Unis. Pendant l’essai, les chercheurs peuvent travailler avec un membre de l’équipe scientifique d’application pour poser des questions et régler l’équipement en fonction de leur flux de travail et de leurs échantillons spécifiques. Une fois satisfaits de leur capacité à compter et à contrôler la qualité de leur échantillon sur le CellDrop, les chercheurs peuvent l’emballer et le renvoyer par la poste. C’est un excellent moyen de tester l’équipement et cela ne coûte rien.
À propos de l’orateur
Ben Capozzoli apporte à l’équipe DeNovix son expertise en immunologie, en imagerie, en biologie cellulaire et en numération cellulaire. Après avoir obtenu sa licence en biologie à l’Université Susquehanna, Ben a occupé un poste d’assistant de recherche à l’Université de Pennsylvanie pour étudier les effets du vieillissement sur les cellules souches de D. melanogaster. Il a ensuite obtenu sa maîtrise en immunologie à l’Université Villanova, ses recherches étant axées sur l’immuno-oncologie. Ben a rejoint l’équipe DeNovix en tant que scientifique d’application en 2019, et depuis lors, il a contribué au développement et au support applicatif du compteur de cellules automatisé CellDrop.
À propos de DeNovix, Inc.
DeNovix Inc. est une société d’instrumentation qui conçoit, fabrique et vend des équipements de laboratoire pour répondre aux demandes en évolution des technologies actuelles des sciences de la vie. Notre objectif est de fournir des produits innovants et un support client exceptionnel. DeNovix est équipé des ressources financières, commerciales et techniques nécessaires pour fournir des produits révolutionnaires pour le succès de votre recherche.
DeNovix propose le spectrophotomètre/fluoromètre série DS-11 qui combine l’analyse de fluorescence et 1 µL UV-Vis dans le même instrument. Associés à notre nouvelle suite de tests de fluorescence d’ADNdb, les instruments DeNovix offrent une plage de quantification plus large que tout autre instrument.
Les instruments DeNovix se trouvent dans les laboratoires de recherche en sciences de la vie du monde entier. Chaque instrument est un système autonome contrôlé par un système d’exploitation Android™ intégré (pas de PC). Les laboratoires apprécient le fonctionnement semblable à celui d’un smartphone, les performances impressionnantes et la connectivité flexible de l’instrument. Apprenez-en davantage sur les instruments DeNovix et sur les avantages qu’ils peuvent apporter à votre laboratoire.