Le génome du coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère génère 16 protéines non structurelles distinctes (nsp) qui constituent les enzymes et les protéines accessoires responsables de la réplication du virus une fois à l’intérieur d’une cellule hôte. Ces complexes protéiques produisent et coiffent des brins d’ARN qui seront ensuite traduits par la machinerie hôte. Le plafonnement de l’ARN d’une manière qui est reconnue comme similaire à l’ARNm endogène assure la compatibilité, diminue les taux de dégradation de l’ARN et diminue la probabilité de déclencher une réponse immunitaire dans la cellule hôte.
Dans un article récemment téléchargé sur le serveur de pré-impression bioRxiv * par Diffley et al. (8 avrile, 2021), les inhibiteurs d’une protéine non structurale essentielle du SRAS-CoV-2 sont explorés, avec quatre composés, en particulier, identifiés comme des pistes antivirales potentielles qui présentent des effets synergiques avec le remdesivir, un médicament antiviral.
La fonction de nsp14
Après la synthèse du brin d’ARN viral, nsp13 est impliqué dans la préparation du brin pour le coiffage en éliminant le groupe phosphate terminal, après quoi nsp12 transfère la structure de capuchon GpppA à l’extrémité 5 ‘de l’ARN. Nsp14, nsp16 et nsp10 finalisent ensuite la structure du capuchon en ajoutant plusieurs groupes méthyle, formant Cap1.
Le groupe a démontré que la méthylation effectuée par le complexe nsp16 / nsp10 dépend de la méthylation préalable du brin par nsp14, et ces deux enzymes nécessitent la présence de S-adénosyl-L-méthionine (SAM), un donneur de méthyle, produisant du S -adénosyl-L-homocystéine (SAH) lors du don. Nsp14 s’est avéré être une guanine-N7 méthyltransférase qui ne peut catalyser que la méthylation de la structure de GpppA de départ.
Nsp14 a été purifié et le groupe a développé un test pour déterminer de manière quantifiable la conversion de SAM en SAH en présence de l’enzyme et de l’ARN coiffé par GppA, déterminant ainsi l’activité de l’enzyme méthyltransférase. Nsp14 a également été testé contre une bibliothèque de plus de 5000 composés chimiques à la recherche de pistes de médicaments antiviraux, appliqués à une concentration de 3,125 μM, et chacun classé en fonction de son efficacité. Les fils conducteurs résultants ont été affinés davantage en supprimant les erreurs de sélection probables, les composés qui seraient difficiles à trouver ou ceux dont la toxicité était connue à la concentration requise indiquée.
Purification de la nsp14 Guanine N7 Méthyltransférase a) Aperçu du génome du SRAS-CoV-2. Pp1a et Pp1ab représentent respectivement les polyprotéines a et ab. Pp1a et pp1ab sont capables de se cliver de manière autoprotéolytique pour former les protéines nsp décrites. Le complexe réplicase / transcriptase virale produit une série d’ARN viraux imbriqués qui codent pour des protéines virales accessoires (orange) ou structurales (vertes). b) Contour de coiffage de l’ARN viral. Le nucléotide ARN initial possède un phosphate γ et β, contrairement aux bases ARN suivantes. Le phosphate y est éliminé par nsp13, suivi de l’addition de Gp par nsp12, libérant du pyrophosphate. nsp14 et nsp16 / 10 catalysent alors la formation de la structure finale Cap-0. c) Gel de Coomassie de clivage His14-SUMO. Colonne de gauche: élution à partir de perles Ni-NTA sans la protéase Ulp1 SUMO-dépendante. À droite: élution à partir de billes Ni-NTA après traitement avec Ulp1 (voir Méthodes). d) Fractions de filtration sur gel de nsp14. À gauche: entrée pour la filtration sur gel. Droite: fractions regroupées du pic principal de l’élution (en bas). nsp14 taille attendue: 55 kDa.
Inhibiteurs Nsp14
Un composé chimique appelé PF-03882845 s’est avéré être l’inhibiteur le plus puissant, présentant une concentration inhibitrice de 50% de 1,1 μM. Trifluperidol, Inauhzin et Lomeguatrib avaient des valeurs CI50 de 12,9 μM, 23 μM et 59,8 μM, respectivement. L’activité de ces médicaments envers le complexe nsp16 / nsp10 a également été testée, et aucun n’a inhibé le complexe, démontrant la spécificité des médicaments envers nsp14.
Les cellules de mammifères ont ensuite été infectées par le SRAS-CoV-2 et les inhibiteurs appliqués, suivis d’une coloration fluorescente des anticorps anti-nucléoprotéines, permettant au groupe de suivre à la fois la charge virale et la cytotoxicité vis-à-vis des cellules. PF-03882845, Inauhzin et Trifluperidol avaient chacun des valeurs de CI50 comprises entre 11 et 13 μM, par ordre de puissance décroissante, tandis que Lomeguatrib nécessitait une concentration de près de 60 μM pour des niveaux d’inhibition similaires. Aucun des médicaments ne s’est avéré cytotoxique dans la lignée cellulaire testée.
Le remdesivir, médicament antiviral, nécessite généralement des concentrations d’environ 1 μM pour abaisser la charge virale dans les cellules testées par le groupe. Pour tester la synergie, le médicament a été appliqué à une concentration de seulement 0,5 μM en combinaison avec l’un des quatre médicaments principaux. Dans ce cas, Inauhzin présentait des valeurs de CI50 similaires lorsqu’il était appliqué seul, tandis que les trois autres médicaments présentaient une synergie significative, ayant des valeurs de CI50 notablement plus faibles. La CI50 du PF-03882845 et du triflupéridol a baissé en particulier, passant à 4,79 μM et 5,05 μM, respectivement.
PF-03882845 et Inauhzin ont déjà fait l’objet d’essais cliniques en tant qu’agoniste des récepteurs des minéralocorticoïdes et inhibiteur de la SIRT, respectivement, bien qu’aucun des deux n’ait encore été approuvé pour l’usage humain. Le triflupéridol est un médicament sous licence utilisé pour traiter diverses psychoses, mais il a été impliqué dans divers effets secondaires néfastes lors d’une utilisation à long terme, et peut donc ne pas constituer un prophylactique COVID-19 idéal. Dans tous les cas, ces médicaments peuvent contribuer au développement de médicaments contre le SRAS-CoV-2 plus efficaces.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
Référence du journal:
- Identification des composés antiviraux du SRAS-CoV-2 par dépistage des inhibiteurs de petites molécules de la nsp14 RNA Cap Methyltransferase, Souradeep Basu, Tiffany Mak, Rachel Ulferts, Mary Wu, Tom Deegan, Ryo Fujisawa, Kang Wei Tan, Chew Theng Lim, Clovis Basier , Berta Canal, Joseph F. Curran, Lucy Drury, Allison W. McClure, Emma L. Roberts, Florian Weissmann, Theresa U. Zeisner, Rupert Beale, Victoria H. Cowling, Michael Howell, Karim Labib, John FX Diffley, bioRxiv, 2021.04.07.438810; doi: https://doi.org/10.1101/2021.04.07.438810, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.07.438810v1