La capacité du foie à se régénérer est légendaire. Même si plus de 70 % de l’organe est retiré, le tissu restant peut faire repousser un tout nouveau foie.
Kristin Knouse, professeure adjointe de biologie au MIT, veut découvrir comment le foie est capable de réaliser ce type de régénération, dans l’espoir d’apprendre comment inciter d’autres organes à faire la même chose. À cette fin, son laboratoire a développé une nouvelle façon d’effectuer des études à l’échelle du génome du foie chez la souris, en utilisant le système d’édition de gènes CRISPR.
Grâce à cette nouvelle technique, les chercheurs peuvent étudier comment chacun des gènes du génome de la souris affecte une maladie ou un comportement particulier. Dans un article décrivant la technique, les chercheurs ont découvert plusieurs gènes importants pour la survie et la prolifération des cellules hépatiques qui n’avaient jamais été observés auparavant dans des études sur des cellules cultivées dans une boîte de laboratoire.
« Si nous voulons vraiment comprendre la physiologie et les maladies des mammifères, nous devons étudier ces processus dans l’organisme vivant dans la mesure du possible, car c’est là que nous pouvons étudier la biologie dans son contexte le plus natif », explique Knouse, qui est également membre du Koch du MIT. Institut de recherche intégrative sur le cancer.
Knouse est l’auteur principal du nouvel article, qui paraît aujourd’hui dans Génomique cellulaire. Heather Keys, directrice de la plateforme de génomique fonctionnelle au Whitehead Institute, est co-auteur de l’étude.
Contexte extracellulaire
En tant qu’étudiant diplômé au MIT, Knouse a utilisé la régénération du tissu hépatique comme modèle pour étudier un aspect de la division cellulaire appelé ségrégation des chromosomes. Au cours de cette étude, elle a observé que les cellules se divisant dans le foie ne se comportaient pas de la même manière que les cellules hépatiques se divisant dans une boîte de laboratoire.
« Ce que j’ai intériorisé à partir de cette recherche, c’est la mesure dans laquelle quelque chose d’aussi intrinsèque à la cellule que la division cellulaire, quelque chose que nous avons longtemps supposé indépendant de tout ce qui se trouve au-delà de la cellule, est clairement influencé par l’environnement extracellulaire », dit-elle. « Lorsque nous étudions des cellules en culture, nous perdons l’impact de ce contexte extracellulaire. »
Cependant, de nombreux types d’études, y compris les écrans à l’échelle du génome qui utilisent des technologies telles que CRISPR, sont plus difficiles à déployer à l’échelle d’un organisme entier. Le système d’édition de gènes CRISPR consiste en une enzyme appelée Cas9 qui coupe l’ADN à un endroit donné, dirigée par un brin d’ARN appelé ARN guide. Cela permet aux chercheurs de désactiver un gène par cellule, dans une énorme population de cellules.
Bien que cette approche puisse révéler des gènes et des protéines impliqués dans des processus cellulaires spécifiques, il s’est avéré difficile de fournir efficacement des composants CRISPR à suffisamment de cellules dans le corps pour le rendre utile pour les études sur les animaux. Dans certaines études, les chercheurs ont utilisé CRISPR pour éliminer environ 100 gènes d’intérêt, ce qui est utile s’ils savent quels gènes ils veulent étudier, mais cette approche limitée ne révèle pas de nouveaux gènes liés à une fonction ou une maladie particulière.
Quelques groupes de recherche ont utilisé CRISPR pour effectuer des dépistages à l’échelle du génome dans le cerveau et dans les cellules de la peau, mais ces études ont nécessité un grand nombre de souris pour découvrir des résultats significatifs.
Pour nous, et je pense que de nombreux autres chercheurs, la traçabilité expérimentale limitée des modèles de souris a longtemps entravé notre capacité à nous plonger dans les questions de physiologie et de maladie des mammifères de manière impartiale et complète. C’est ce que je voulais vraiment changer, apporter la traçabilité expérimentale qui était autrefois limitée à la culture cellulaire dans l’organisme, afin que nous ne soyons plus limités dans notre capacité à explorer les principes fondamentaux de la physiologie et de la maladie dans leur contexte d’origine.
Kristin Knouse, professeure adjointe de biologie, MIT
Pour obtenir des brins d’ARN guides dans les hépatocytes, le type de cellule prédominant dans le foie, Knouse a décidé d’utiliser le lentivirus, un virus non pathogène modifié qui est couramment utilisé pour insérer du matériel génétique dans le génome des cellules. Elle a injecté les ARN guides à des souris nouveau-nées, de sorte qu’une fois l’ARN guide intégré dans le génome, il serait transmis aux générations futures de cellules hépatiques au fur et à mesure de la croissance des souris. Après des mois d’efforts en laboratoire, elle a pu obtenir des ARN guides exprimés de manière cohérente dans des dizaines de millions d’hépatocytes, ce qui est suffisant pour effectuer un dépistage à l’échelle du génome chez un seul animal.
Remise en forme cellulaire
Pour tester le système, les chercheurs ont décidé de rechercher des gènes qui influencent la forme physique des hépatocytes – la capacité des hépatocytes à survivre et à proliférer. Pour ce faire, ils ont fourni une bibliothèque de plus de 70 000 ARN guides, ciblant plus de 13 000 gènes, puis ont déterminé l’effet de chaque knock-out sur la forme physique des cellules.
Les souris utilisées pour l’étude ont été conçues de manière à ce que Cas9 puisse être activé à tout moment de leur vie. En utilisant un groupe de quatre souris – deux mâles et deux femelles – les chercheurs ont activé l’expression de Cas9 lorsque les souris avaient cinq jours. Trois semaines plus tard, les chercheurs ont examiné leurs cellules hépatiques et mesuré la quantité de chaque ARN guide présent. Si un ARN guide particulier est abondant, cela signifie que le gène qu’il cible peut être éliminé sans endommager mortellement les cellules. Si un ARN guide n’apparaît pas à l’écran, cela signifie que l’élimination de ce gène a été fatale pour les cellules.
Cet écran a produit des centaines de gènes liés à la forme physique des hépatocytes, et les résultats étaient très cohérents entre les quatre souris. Les chercheurs ont également comparé les gènes qu’ils ont identifiés à des gènes qui ont été liés à une maladie du foie chez l’homme. Ils ont découvert que les gènes mutés dans les syndromes d’insuffisance hépatique néonatale provoquaient également la mort des hépatocytes dans leur dépistage.
L’écran a également révélé des gènes de fitness critiques qui n’avaient pas été identifiés dans des études sur des cellules hépatiques cultivées dans une boîte de laboratoire. Beaucoup de ces gènes sont impliqués dans des interactions avec les cellules immunitaires ou avec des molécules de la matrice extracellulaire qui entoure les cellules. Ces voies ne sont probablement pas apparues dans les criblages effectués dans des cellules en culture car elles impliquent des interactions cellulaires avec leur environnement externe, explique Knouse.
En comparant les résultats des souris mâles et femelles, les chercheurs ont également identifié plusieurs gènes qui avaient des effets spécifiques au sexe sur la condition physique, ce qui n’aurait pas été possible de détecter en étudiant uniquement les cellules.
Renouveler et régénérer
Knouse prévoit maintenant d’utiliser ce système pour identifier les gènes qui sont essentiels à la régénération du foie.
« De nombreux tissus comme le cœur sont incapables de se régénérer car ils manquent de cellules souches et les cellules différenciées sont incapables de se diviser. Cependant, le foie est aussi un tissu hautement différencié qui manque de cellules souches, mais il conserve cette incroyable capacité à se régénérer après une blessure », dit-elle. « Il est important de noter que le génome des cellules hépatiques n’est pas différent du génome des cellules cardiaques. Toutes ces cellules ont le même manuel d’instructions dans leur noyau, mais les cellules du foie lisent clairement des phrases différentes dans ce manuel afin de se régénérer. Ce que nous ne savons pas, c’est quelles sont ces phrases ? Quels sont ces gènes ? Si nous pouvons identifier ces gènes, peut-être qu’un jour nous pourrons demander au cœur de se régénérer.
Cette nouvelle technique de dépistage pourrait également être utilisée pour étudier des conditions telles que la stéatose hépatique et la cirrhose. Le laboratoire de Knouse travaille également à étendre cette approche à des organes autres que le foie.
« Nous devons trouver des moyens d’obtenir des ARN guides dans d’autres tissus avec une grande efficacité », dit-elle. « En surmontant cette barrière technique, nous pouvons alors établir la même traçabilité expérimentale que nous avons maintenant dans le foie, le cœur ou d’autres problèmes. »
La recherche a été financée par le prix de l’indépendance précoce du directeur des NIH des National Institutes of Health, la subvention de soutien (de base) de l’Institut Koch du National Cancer Institute et le Scott Cook and Signe Ostby Fund.
