Une étude récente publiée sur bioRxiv* Le serveur de préimpression a décrit la fabrication sans cellule de la griffithsine (GRFT), une protéine antivirale à large spectre.
Les médicaments et les vaccins sont actuellement fabriqués dans de grandes installations coûteuses. Le composé médicamenteux est largement testé et caractérisé pour sa puissance et sa pureté et doit être évalué pour sa sécurité et son efficacité dans des essais cliniques. Les installations de production sont centralisées et s’appuient sur des chaînes d’approvisionnement bien développées pour la distribution.
Les anticorps monoclonaux (mAbs) ont joué un rôle central lors de la pandémie de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), mais leur production est coûteuse et laborieuse. De plus, étant donné que les variantes du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) développent rapidement une résistance aux mAb et à d’autres antiviraux, il existe un besoin pressant d’antiviraux tout aussi efficaces contre les variantes émergentes qui peuvent être facilement fabriquées.
L’étude et les conclusions
Dans la présente étude, les chercheurs ont décrit une approche pour la production rapide de GRFT à l’aide de méthodes de synthèse de protéines sans cellules végétales et bactériennes (CFPS). Tout d’abord, GRFT CFPS a été évalué en Escherichia coli en utilisant un gène contenant les codons fréquemment utilisés. Cela a entraîné une faible solubilité du produit (50 %) et un faible rendement (200 μg/ml), malgré les températures d’expression, les ajouts de chaperon, les forces ioniques, les concentrations d’acides aminés et les temps d’incubation.
Ensuite, un nouveau gène GRFT a été conçu avec cinq codons sérine et quatre codons glycine, compte tenu de la fréquence élevée de glycine et de sérine dans GRFT. Cette construction a été encore optimisée pour minimiser la stabilité des structures secondaires potentielles d’ARNm. Ce gène optimisé (tagless-GRFT.opt) a entraîné une accumulation de protéines environ quatre fois supérieure (900 μg/ml) et une solubilité multipliée par six (80 %).
Le système ALiCE incorporant des extraits de cellules de tabac a été utilisé pour le GRFT CFPS à base de plantes. Les plasmides pALiCE-01 et pALiCE-02 ont été utilisés pour l’accumulation cytosolique et microsomique, respectivement. Les auteurs ont utilisé un gène GRFT marqué à l’hexahistidine N-terminal pour l’expression d’ALiCE, étant donné l’absence apparente de modifications post-traductionnelles importantes dans GRFT.
L’accumulation microsomale avec le plasmide pALiCE-02 n’a pas été détectée, alors qu’avec l’autre plasmide, le rendement total en protéines était de 410 μg/ml et le produit était soluble à 75 %. Le produit marqué a été purifié par chromatographie d’affinité sur métal immobilisé (IMAC) avec une récupération de 36 % après élution d’imidazole. Environ 33 % du mélange GRFT marqué a été collecté dans la fraction d’écoulement, ce qui suggère une collecte incomplète.
Par conséquent, les chercheurs ont utilisé une purification optimisée induite par la chaleur, conduisant à une récupération de 50 % du produit marqué soluble. L’homodimérisation complète de GRFT a été confirmée en utilisant la chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Le poids moléculaire du GRFT marqué, purifié par IMAC et précipitation à la chaleur, était de 31,2 kDa et 29,8 kDa, respectivement.
L’estimation de la SEC pour le poids moléculaire du GRFT sans étiquette était inférieure au poids moléculaire réel. Pourtant, il est resté dans l’erreur expérimentale anticipée, suggérant que l’étiquette hexahistidine aurait pu entraîner une structure tertiaire plus grande que prévu. L’analyse par chromatographie liquide haute performance-temps de vol-spectrométrie de masse (HPLC-TOF-MS) des produits GRFT dans les deux systèmes CFPS a indiqué que les poids moléculaires étaient conformes à ceux anticipés.
Ensuite, les chercheurs ont déterminé si GRFT était fonctionnellement actif contre les virus. La protéine a d’abord été évaluée pour sa capacité à se lier à la glycoprotéine d’enveloppe (gp120) du virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1). Alice et E. coli Le GRFT exprimé par un système sans cellule présentait une affinité de liaison comparable à la gp120, ce qui implique que les deux systèmes CFPS pourraient produire un GRFT actif.
Enfin, l’équipe a étudié si GRFT pouvait inhiber la liaison du SRAS-CoV-2 à l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) dans un test de pseudovirus. La concentration inhibitrice semi-maximale (IC50) de tagged-GRFT et tagless-GRFT.opt a été estimé à 510 nm et 324 nm, respectivement, conformément aux estimations précédemment rapportées. De plus, le GRFT n’était pas cytotoxique pour les cellules de mammifères, même à la concentration testée la plus élevée.
conclusion
En résumé, l’équipe a démontré la synthèse de GRFT biologiquement actif dans les systèmes CFPS à base de bactéries et de plantes en moins de 24 heures. Le système CFPS bactérien a été exploré pour la première fois, compte tenu de son optimisation poussée au cours des dernières décennies. Néanmoins, les rendements en protéines étaient initialement faibles.
Une optimisation supplémentaire des codons et de la stabilité de la structure secondaire de l’ARNm a entraîné de profondes améliorations du rendement en protéines. Les auteurs ont découvert que la plus faible concentration d’ADN plasmidique (10 ng/ml) dans le système ALiCE entraînait le rendement en protéines solubles le plus élevé. Ils ont émis l’hypothèse que l’optimisation des codons dans le système ALiCE, telle qu’elle est effectuée dans le E. coli Le système CFPS peut également augmenter le rendement en protéines.
La production décentralisée de GRFT et d’autres produits biologiques peut être rendue possible en intégrant le bioprocédé CFPS à une plate-forme de fabrication automatisée telle que la fabrication de produits biologiques à la demande (Bio-MOD), qui permettra une réponse adaptée et efficace dans les régions ayant des défis en matière de la chaîne d’approvisionnement des antiviraux.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
