Alors que le COVID-19 poursuit sa montée en contamination inexorable, faisant des centaines de milliers de morts et causant près de 11 millions de cas, le diagnostic de l’infection n’est toujours pas suffisamment sensible ou précis.
Quel test est le meilleur pour diagnostiquer le COVID-19 ?
Dorénavant, une nouvelle étude par des scientifiques du Francis Crick Institute et publiée sur le serveur de recherche médicale medRxiv (archive de prépublications consacrée à la recherche médicale) en juin 2020. Cette étude décrit une procédure opératoire standard (SOP) pour permettre la détection rapide et à haut débit du Coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SARS-CoV-2) par un test RT-LAMP. Cela permettrait une méthode de détection fiable, reproductible et rentable.
Sommaire
La raison de cette nouvelle étude
La présente étude a été motivée par l’expérience des chercheurs de leur institut de recherche biomédicale, au début de la phase de pic de la pandémie. Ils ont mis en place un flux de travail pour les tests de diagnostic en partenariat avec les hôpitaux affiliés et un laboratoire de diagnostic accrédité afin d’augmenter la capacité de test, en particulier pour les agents de santé.
Ils ont d’abord utilisé un ensemble de tampons pour l’inactivation virale, suivi de l’extraction d’ARN et d’un système de déclaration en ligne. Malgré le signalement des résultats des tests de détection virale sur plus de 40000 échantillons RT-PCR, depuis le début du mois d’avril 2020, ils ont réalisé qu’ils n’étaient pas en mesure de répondre à la demande et qu’ils avaient utilisé trop de ressources.
« À mesure que les restrictions de verrouillage sont levées, il est absolument vital de tester les personnes pour ce coronavirus et, si nécessaire, de les informer et de leurs contacts étroits pour s’auto-isoler. Sans tests efficaces, le virus peut se propager rapidement à travers les communautés, provoquant de nombreux décès », explique l’auteur de l’étude Caetano Reis e Sousa.
RT-LAMP pour la détection du SRAS-CoV-2
La présente étude est le fruit de leur deuxième objectif, publier des stratégies alternatives validées qui permettraient une plus grande indépendance que le RT-PCR, augmenteraient la capacité de test et peut-être permettraient des diagnostics instantanés et facile d’utilisation. Les chercheurs ont utilisé la PCR d’amplification isotherme médiée par boucle avec la transcription inverse, appelée RT-PCR, pour détecter le SRAS-CoV-2. L’ensemble de la procédure est terminée en 30 minutes et ne nécessite pas la nécessité d’un thermocycleur qPCR.
Cette technique a déjà été développée pour les virus à ARN et autres microbes, et même pour le SRAS-CoV-2. L’étude actuelle a utilisé la méthode pour permettre une quantification visuelle ou par un colorant ADN. Ils ont utilisé des amorces déjà développées pour cibler le gène N du virus ainsi que des amorces qui détectent l’ARN 18S pour un contrôle de qualité parallèle.
Avantages de RT-LAMP
Les résultats montrent que RT-LAMP est entièrement capable d’être utilisé à la place de RT-qPCR comme moyen de détection du SRAS-CoV-2. Cette méthode évite non seulement l’amplification non spécifique et à réactivité croisée par d’autres CoV humains ou virus respiratoires tout en étant presque aussi sensible que le RT-qPCR.
Le coût total du réactif est décuplé. Il est également beaucoup plus rapide, donnant des résultats en 25 minutes, ce qui signifie que la sortie peut être quadruplée. Cela aiderait à déterminer si une personne testée devrait s’isoler d’elle-même et réduire fortement le risque de propagation virale.
Éviter l’étape d’extraction d’ARN
Les premières données de la présente étude indiquent également que l’étape d’extraction d’ARN ne sera pas nécessaire, ce qui réduira encore le coût et permettra des résultats plus rapides, même des tests au point de service. L’ensemble de la méthode a également été validé par les autorités de santé publique et accrédité selon les normes en vigueur, permettant un déploiement immédiat.
Le test a été validé sur 24 échantillons de patients. Les 12 échantillons positifs se sont révélés positifs et les 12 échantillons négatifs n’ont pas affiché d’amplification, ce qui correspond dans tous les cas à la plate-forme de diagnostic actuelle.
Des résultats fiables et spécifiques
Le seuil de détection a été fixé, sur la base des données précédentes, pour permettre un temps d’exécution maximal de 25 minutes pour le gène N et de 20 minutes pour l’ARNr 18S. Avec ces critères, il n’y avait aucun faux positif dans le dosage du SARS-CoV-2. L’utilisation d’une courbe de fusion conventionnelle a permis d’éliminer les faux positifs et d’augmenter la fiabilité des résultats.
La spécificité du test a été évaluée en utilisant des échantillons cliniques de patients sans COVID-19, mais avec plusieurs autres coronavirus saisonniers, les virus de la grippe A et B et d’autres virus à ARN. Aucun des échantillons n’était positif avec le test RT-LAMP pour le gène N, montrant sa haute spécificité.
RT-LAMP a une sensibilité comparable au PCR
Pour doser sa sensibilité, l’échantillon utilisé était un échantillon standard évalué en limitant la dilution pour trouver la limite de détection fiable. La limite de détection (LOD) se situait entre 500 et 1 000 copies du gène N. La reproductibilité et la précision de la technique ont été trouvées par une extraction à cinq tours et un dosage d’ARN à partir d’un échantillon positif, puis en exécutant le test pour le gène N et l’ARNr 18S.
Ensuite, le test a été comparé aux méthodes standard RT-qPCR sur 37 échantillons. Les résultats ont montré un accord à 100% pour la détection des positifs, mais lorsque le temps de cycle pour les positifs était proche de la limite de détection, les positifs limites n’ont pas été détectés de manière fiable par l’analyse du gène N, mais ont été détectés par l’analyse de l’ARNr 18S.
Des expériences répétées ont montré que la RT-LAMP n’identifiait pas toujours l’ARN viral dans les échantillons analysés en double lorsque les temps de cycle se situaient à moins de 2 cycles de la LOD des tests de RT-PCR. Cela indique une sensibilité légèrement inférieure de RT-LAMP par rapport à la PCR sur l’ARN extrait. Cependant, le premier a été exécuté avec seulement un tiers de l’ARN d’entrée utilisé pour la PCR. Deuxièmement, certaines recherches récentes suggèrent que l’ajout de guanidine pourrait améliorer la sensibilité de détection avec RT-LAMP.
Implications
Enfin, l’utilisation de RT-LAMP sans extraction préalable d’ARN a montré un accord de 94% avec les résultats de RT-PCR, ce qui montre que cette étape pourrait être potentiellement omise. Cependant, les chercheurs avertissent que cette découverte nécessite une validation avec des échantillons cliniques réels.
Si elle est également associée à une lecture colorimétrique à partir d’une machine de génération de rapports à base de colorant, la réduction des coûts et du temps qui en résulte pourrait produire un flux de travail de diagnostic très compétitif et peu coûteux capable d’une application sur le lieu de soins et d’une utilisation dans des zones éloignées et pauvres.
« Nous espérons que cela pourra aider les installations nouvelles ou existantes à se développer et à améliorer l’efficacité de leurs tests. » Michael Buck, co-auteur de l’étude
