Une étude récente publiée sur bioRxiv* Le serveur de pré-impression a évalué la capacité des oligonucléotides à prévenir le développement des virions infectieux du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2).
Les variants préoccupants (COV) émergents du SRAS-CoV-2 et leur transmissibilité associée ont aggravé l’impact de la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Le développement de médicaments thérapeutiques contre le virus nécessite la connaissance des mutations indispensables dans les nouveaux COV qui peuvent être ciblés pour l’inhibition.
Étude : Coronavirus paralysé : l’oligo ciblé 5′-PolyU empêche le développement de virions infectieux. Crédit d’image : unoL / Shutterstock
Sommaire
À propos de l’étude
La présente étude a émis l’hypothèse de l’inhibition du tractus 5′-polyuridine (polyU) de l’antigénome viral à l’aide d’oligonucléotides complémentaires pour limiter la génération de virus à acide ribonucléique (ARN).
L’équipe a développé deux oligonucléotides en utilisant des séquences génomiques de la souche A59 du virus de l’hépatite de la souris (MHV), qui est la souche prototype du CoV. Ces oligonucléotides étaient complémentaires des polyU présents à l’extrémité 5′ du brin moins du génome viral. Les oligonucléotides conçus avaient 21 acides 3′-polyadényliques (polyA) et 11 bases, qui étaient complémentaires des polyA flanquants, ce qui a aidé les oligonucléotides à faire la distinction entre les 5′-polyU et les 3′-polyU dans le génome. Une mutation de décalage de cadre a également été produite pour déterminer les capacités des oligonucléotides en tant qu’amorce.
Les oligonucléotides ont été complexés et transfectés dans les cellules infectées à l’aide de polymères cationiques. La complexation de l’oligonucléotide a été réalisée via des interactions électrostatiques du
squelette d’acide désoxyribonucléique (ADN) avec le système de délivrance. Le véhicule de délivrance de l’oligonucléotide a été formulé avec un agent de délivrance à base de polymère ou à base de lipide. L’étude a également impliqué des cellules témoins qui ont été traitées uniquement avec un polymère. Le développement de virions infectieux basé sur une infection primaire d’oligonucléotides a été évalué en examinant tous les effets infectieux induits par le virus dans les cellules secondaires.
L’équipe a ensuite étudié le potentiel des oligonucléotides dans la prévention de la génération de virions dans les cellules en isolant les protéines du virion des cellules traitées et des cellules témoins. Le western blot a ensuite été utilisé pour détecter la présence de la protéine virale de la nucléocapside (N). Enfin, le potentiel d’infection des virions libérés par les cellules traitées avec l’oligonucléotide a été analysé à l’aide des virions libérés détectés dans le milieu.
En outre, la réplication des virions présents dans les cellules traitées par l’oligonucléotide a été détectée à l’aide de tests pour les complexes réplicase-transcriptase (RTC), qui se trouvent de manière caractéristique dans les cellules infectées par le virus. Ce test était basé sur la détection d’intermédiaires d’ARN double brin (ds-ARN) qui étaient considérés comme un marqueur pour la synthèse d’ARN viral dans les cellules infectées.
Résultats
Les résultats de l’étude ont montré que les cellules témoins présentaient une nette infectiosité due au virus, avec des infections concentrées autour de foyers spécifiques. En outre, la formation d’un syncytium due à de nombreuses fusions cellule à cellule a été observée, ce qui indique une production importante de virions dans les cellules secondaires.
Les cellules traitées avec des oligonucléotides avaient quelques cellules secondaires positives pour les protéines fluorescentes vertes (GFP), tandis que de rares formations de syncytium ont également été trouvées. Cependant, certaines cellules secondaires ont montré une GFP-positivité en présence d’oligonucléotide sans aucun effet cytopathique ni aucune formation de syncytium. Ceci suggérait que les cellules traitées avec des oligonucléotides ne produisaient aucun virion fonctionnel entièrement formé.
Le Western blot a montré que les virions libérés présentaient une génération importante de protéines N dans les cellules témoins. Dans le même temps, des niveaux insignifiants de protéines N ont été trouvés dans les cellules traitées aux oligonucléotides. De plus, les milieux des cellules traitées par le polymère ne contenaient aucune protéine N, tandis que les milieux obtenus à partir de cellules traitées par l’oligonucléotide ne présentaient qu’une quantité légèrement inférieure de protéines N. Globalement, il a été observé que les cellules traitées avec l’oligonucléotide étaient capables d’inhiber la formation de protéines essentielles à la production de virions fonctionnels. La résolution de fond des transferts Western a trouvé des bandes de poids moléculaire plus élevé produites dans les cellules témoins alors qu’aucune de ces bandes n’était présente dans les cellules traitées avec l’oligonucléotide.
Lors de l’analyse des virions obtenus à partir des milieux des cellules traitées avec l’oligonucléotide et des cellules témoins, il a été constaté que les milieux des cellules traitées avec le polymère contenaient des virions fonctionnels qui provoquaient un effet cytopathique dans les cellules secondaires après seulement six heures d’addition au cellules secondaires. D’autre part, les milieux des cellules traitées avec l’oligonucléotide n’ont eu aucun effet cytopathique dans la phase précoce de l’infection. De plus, après 24 heures, les milieux des cellules témoins étaient GFP-positifs dans presque toutes les cellules secondaires, tandis que seules quelques cellules secondaires étaient positives pour la présence de virions infectieux dans les milieux des cellules traitées avec l’oligonucléotide.
L’étude des processus de synthèse d’ARN dans les cellules traitées avec l’oligonucléotide a montré que l’oligonucléotide inhibait efficacement la génération d’intermédiaires ds-ARN tandis que les cellules témoins indiquaient une infection active avec le développement des intermédiaires.
Conclusion
Les résultats de l’étude ont montré que les oligonucléotides pouvaient cibler avec succès les 5′-polyU dans le génome du coronavirus de souris. Les chercheurs ont estimé que le développement de médicaments thérapeutiques contre le COVID-19 à l’aide de cibles mutationnelles indispensables comme le tractus 5′-polyU peut aider à atténuer la génération et la transmission des COV émergents du SRAS-CoV-2.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
