Dans une étude récente publiée dans le Actes de l’Académie nationale des sciencesles chercheurs ont démontré le confinement biologique des bactériophages et l’ingénierie synthétique.
Les graves dangers posés par les maladies bactériennes résistantes aux médicaments et les progrès récents de la biologie synthétique ont attiré une attention particulière sur les phages génétiquement modifiés ayant un potentiel thérapeutique. Jusqu’à présent, de nombreuses études sur les phages modifiés se sont limitées à la preuve de concept (POC) ou à la recherche fondamentale utilisant des phages avec des génomes relativement courts ou des « kits de présentation de phages ». De plus, aucune précaution garantissant une traduction efficace pour une application pratique n’a été mise en œuvre.
À propos de l’étude
La présente étude a créé une plate-forme pour l’ingénierie et le redémarrage des phages sans cellules.
Tout d’abord, l’équipe a cherché à redémarrer plusieurs phages de type sauvage (WT) qui infectaient les bactéries gram-négatives et les mycobactéries acido-résistantes à l’aide de génomes assemblés in vitro. La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) a été utilisée pour amplifier le génome du phage entièrement assemblé obtenu à partir de l’acide désoxyribonucléique (ADN) généré chimiquement ou du génome du phage modèle. Des amorces ont été développées pour générer des zones homologues de 28 pb à 65 pb dans chaque fragment de PCR adjacent. Ces pièces ont été assemblées et électroporées dans des bactéries hôtes, ce qui a entraîné la réactivation des phages.
L’équipe a développé des fragments permettant à la jointure d’extrémité de redémarrer les phages dérivés de génomes circulaires. Le coliphage lambda a été efficacement réactivé à partir de cinq fragments dans le phage Salmonella P22 et E. coli, ainsi que de quatre fragments présents dans S. Typhimurium LT2. Le mycophage modèle D29, qui infecte les Mycobacterium spp acido-résistants et possède un génome riche en guanine-cytosine, a également été redémarré. Cinq fragments d’ADN ont été produits pour créer le génome circulaire.
Résultats
Le coliphage modèle T7, ayant un génome linéaire, a présenté une concatémérisation linéaire au moment de la réplication et a été utilisé pour évaluer la stratégie d’étude. Le génome linéaire a été construit à partir de quatre fragments de PCR puis électroporé dans E. coli pour réactiver le phage T7. Il a été prédit que le coliphage T3, le phage gh-1 de Pseudomonas et le phage SP6 de Salmonella auraient des architectures génomiques et des cycles de vie comparables à ceux de T7. L’équipe a également réussi à régénérer T3 à partir de fragments d’ADN d’E. coli, SP6 à partir de fragments d’ADN de Salmonella Typhimurium LT2 et gh-1 à partir de fragments d’ADN de Pseudomonas putida. Ces résultats ont démontré que les directives et la méthodologie de conception de l’étude étaient efficaces pour redémarrer les phages à partir de génomes linéaires assemblés.
Le mycophage fonctionnel D29, un mycophage B1 non caractérisé, et GS4E ont été redémarrés à partir de M. smegmatis mc2 155. Le mycophage TM4 a été construit à partir de six segments d’ADN produits chimiquement sur la base de ses données de séquence accessibles au public. Les fragments d’ADN ont subi une amplification pour démontrer un chevauchement de 28 pb à 38 pb avec des parties adjacentes, purifiés puis circularisés in vitro. Le génome a été introduit dans M. smegmatis mc2 155. Le TM4 synthétique fonctionnel, dont le génome a été produit chimiquement, a été redémarré. L’ensemble du génome synthétique de TM4 a été séquencé par MiSeq et s’est avéré identique à 100 % au TM4 référencé, indiquant un redémarrage efficace du phage à partir des données de séquence.
Le phage T7 bien caractérisé a été choisi comme modèle pour l’enquête POC. La machinerie T7 a identifié une séquence signal d’encapsidation (Pac) pour « emballer » ou « stocker » son génome dans une particule de tête T7. Pac comprend PacB et PacC. La petite sous-unité gp18 de la terminase se lie au complexe gp19-prohead de la sous-unité pour la translocation de l’ADN dans la tête du phage. Suite à l’empaquetage de la tête, l’équipe a noté que la gp19 se clive au PacC dans le génome du phage T7 concatémère, conduisant à la maturation de la tête T7.
Ensuite, un plasmide contenant le Pac et « votre gène préféré » (yfg) a été créé et injecté dans E. coli. L’électroporation du génome dans les cellules d’E. coli contenant le plasmide a produit des particules transductrices synthétiques à base de T7 (T7Pac). Dans la cellule, le génome dépourvu de Pac a généré des virions descendants avant d’emballer le plasmide contenant Pac dans des particules de tête, donnant T7Pac-yfg. En utilisant cette méthode, l’équipe a synthétisé T7Pac-lacZ, un plasmide hébergeant lacZ. Le lysat a été combiné avec E. coli déficient en lacZ, suivi d’un placage avec des plaques LB X-gal. Ainsi, 1,6×104 Des UFC/mL de T7Pac-lacZ ont été générés et toutes les colonies qui se sont formées étaient bleues. Sur le tapis bactérien, T7Pac-lacZ n’a pas développé de plaques, suggérant un confinement biologique.
L’équipe a construit le génome du phage SP6 moins le gène 31 codant pour la protéine de capside. Le génome a été introduit dans la souche LT2 de S. Typhimurium, qui exprimait le gène 31. Par PCR, la suppression du gène 31 du SP6 synthétiqueΔtête a été confirmé. Le titre élevé SP6 obtenuΔtête le lysat a développé des plaques sur un tapis de LT2 qui exprimait le gène 31, qui n’étaient pas présents sur le LT2 parental.
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont démontré la génération de phages naturels et artificiels qui infectent les bactéries gram-négatives et les mycobactéries acido-résistantes via in vitro assemblage du génome.
