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Les chercheurs évaluent un test d'amplification isothermique à médiation en boucle (LAMP) à l'aide de réactifs secs pour la détection du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2). Ils ont trouvé que le kit de test était très spécifique et sensible. Cette méthode pourrait permettre un diagnostic au point de service dans des établissements à faible coût.
La propagation rapide de la pandémie COVID-19 causée par le virus SRAS-CoV-2 a nécessité le développement de méthodes de diagnostic permettant d'identifier rapidement si un patient a été infecté par le virus. Une détection rapide du virus est essentielle, car de nombreux symptômes de l'infection, comme la fièvre et la toux, sont similaires à la grippe saisonnière ou à d'autres maladies respiratoires. De plus, de nombreux patients présentent des symptômes légers ou sont asymptomatiques.
Le test le plus couramment utilisé est la réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse en temps réel (RT-PCR). La méthode nécessite un thermocycleur spécial et des optiques de précision pour mesurer la fluorescence émise par les échantillons. Ces exigences empêchent généralement son utilisation dans les lieux de soins (POC).
Une autre méthode appelée méthode d'amplification isothermique à médiation par boucle (LAMP) peut amplifier l'ADN dans des conditions isothermes avec une spécificité et une sensibilité élevées. Cette méthode est moins chère et plus rapide que la RT-PCR et a été utilisée dans les tests POC de nombreuses maladies.
Micrographie électronique à transmission de particules de virus SRAS-CoV-2, isolées d'un patient. Image capturée et mise en valeur des couleurs au centre de recherche intégré (IRF) du NIAID à Fort Detrick, Maryland. Crédit: NIAID
Test du test LAMP avec des réactifs secs
Dans une nouvelle étude publiée sur le serveur de pré-impression medRxiv*, les chercheurs ont évalué la pertinence du kit de détection Loopamp SARS-CoV-2 d'Eiken Chemica, Japon, pour détecter le SARS-CoV-2. Il s'agit d'une méthode LAMP qui utilise des réactifs secs pour l'amplification de l'ARN.
Les réactifs secs sont plus stables que les réactifs liquides, ne nécessitent pas de congélateur pour le stockage et sont plus faciles à manipuler.
Cela permettra à la méthode d'être utilisée à faible coût et dans les pays en développement, car les réactifs peuvent être conservés au réfrigérateur à environ 4 ° C et ne nécessitent pas de transport et de stockage rigoureux dans la chaîne du froid.
Pour évaluer la méthode LAMP, les chercheurs ont d'abord extrait l'ARN de prélèvements nasaux et de gorge de patients. Ils ont effectué une transcription inverse (RT) -LAMP en utilisant le kit de détection Loopamp SARS-CoV-2 d'Eiken Chemical.
Tous les réactifs, à l'exception des amorces, sont séchés et immobilisés à l'intérieur du couvercle du tube. Les auteurs ont ajouté l'ARN purifié et les ensembles d'amorces spécifiques du SARS-CoV-2 au fond du tube et ont secoué le tube plusieurs fois pour remettre en suspension l'enzyme et le tampon. Ils ont incubé le mélange, recueilli au fond du tube par centrifugation, pendant 35 minutes à 62,5 ° C.
Pour tester la sensibilité du kit, les auteurs ont testé 22 virus, dont le coronavirus du SRAS, le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS), d'autres coronavirus humains et des virus de la grippe.
Ils n'ont observé aucune amplification de virus autres que le SARS-CoV-2, indiquant que le test était spécifique au virus. Les chercheurs ont confirmé ces résultats en utilisant un test de turbidité et une analyse par électrophorèse sur gel d'agarose.
Pour définir la sensibilité du test, les chercheurs ont utilisé in vitro ARN transcrit dilué en série dans un tampon et utilisé un ARN porteur à une concentration de 50 ng / mL pour définir la limite de détection.
La limite de détection trouvée par les auteurs était de 10 copies / réaction en utilisant des tests de turbidité et des changements de couleur observés à l'œil et en utilisant un éclairage UV. Ceci est similaire ou légèrement supérieur à ceux des tests LAMP pour le SARS-CoV-2.
Échantillons cliniques
Les auteurs ont également évalué leur test en utilisant 24 échantillons cliniques, qui comprenaient trois personnes asymptomatiques qui étaient en contact étroit avec des patients COVID-19. Les échantillons ont été collectés entre le 7 mars et le 30 avril 2020.
En utilisant la RT-PCR, 19 des 24 échantillons se sont révélés positifs pour le SRAS-CoV-2, tandis que 15 échantillons ont montré des résultats positifs en utilisant le test LAMP évalué par les auteurs.
Les quatre échantillons faussement négatifs, collectés plus de 7 jours après le début de la maladie, présentaient de faibles copies d'ARN viral de moins de 10 copies / réaction, qui est la limite de détection du nouveau test. Deux des quatre échantillons faussement négatifs ont été prélevés aux jours 18 et 20 pour confirmer l'absence du virus avant la sortie de l'hôpital.
Par conséquent, les auteurs ont calculé que la spécificité, la sensibilité, la valeur prédictive positive et la valeur prédictive négative étaient de 100%, 78,9%, 100% et 55,6%, respectivement.
«Étant donné que le test de turbidité et les changements colorimétriques ont détecté tous les échantillons avec plus de 4,4 copies / réaction, nous pensons que cette méthode LAMP sèche SARS-CoV-2 est fiable pour une utilisation clinique dans le diagnostic du COVID-19», écrivent les auteurs.
Une étude précédente a rapporté que l'ARN du SRAS-CoV-2 peut être amplifié dans le test LAMP sans extraction. L'intégration d'une telle méthode sans extraction d'ARN pourrait aider à une version de détection directe de la méthode de test pour les tests POC.
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / le comportement lié à la santé ou être traités comme des informations établies.
