Une nouvelle fascinante Méthodes des rapports de cellule étudier ajoute à l’ensemble des connaissances sur la biologie du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), l’agent pathogène qui cause la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). En utilisant la microscopie confocale à super-résolution à haut débit, les scientifiques ont pu visualiser le coronavirus humain structurellement similaire HCoV-229E.
Étudier: Imagerie à super-résolution multicolore pour étudier l’ARN du coronavirus humain pendant une infection cellulaire. Crédit d’image : CROCOTHERIE / Shutterstock.com
introduction
Sept coronavirus se sont révélés être des agents pathogènes humains. Plusieurs d’entre eux ont causé des maladies graves, avec des résultats souvent mortels. L’organisation subcellulaire des composants viraux dans les cellules infectées et la façon dont ces composants agissent dans la cellule dans divers compartiments font partie intégrante de la biologie virale.
En conséquence, les scientifiques ont utilisé plusieurs approches pour capturer ce processus, notamment la génomique, la biochimie et diverses techniques d’imagerie à haute résolution. Cela comprend la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) et la tomographie cryo-électronique (cryoET), grâce auxquelles les scientifiques ont visualisé la structure interne détaillée de ces virus dans la cellule hôte, fournissant ainsi des preuves visuelles de leur cycle de vie assez bien connu.
Malgré ces progrès, la localisation spatiale de l’acide ribonucléique viral (ARN) dans la cellule infectée à différents stades de l’infection reste largement inconnue. Les molécules réelles impliquées, à la fois les protéines hôtes et virales, ne peuvent pas être identifiées.
Résultats de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé un cadre d’imagerie par fluorescence multicolore et à plusieurs échelles pour examiner ces interactions à différents stades de l’infection virale et observer le virus en cours de réplication lors de l’infection cellulaire.
De plus, les scientifiques ont marqué l’ARN viral, qui comprenait à la fois l’ARN génomique et l’ARN double brin (ARNg et ARNdb, respectivement). Grâce à ces techniques, les chercheurs ont visualisé la localisation de l’ARNg et de l’ARNdb à une résolution nanométrique de 20 nanomètres (nm).
L’ARNg et l’ARNdb ont été organisés en trois types de structures différents, dont les grappes d’ARNg, les petits points ponctuels à l’échelle nanométrique et les points ponctuels ronds à l’échelle intermédiaire. Les grappes d’ARNg sont considérées comme des modifications induites par le virus du réticulum endoplasmique (RE) appelées grappes alambiquées, qui contiennent jusqu’à des centaines de copies d’ARNg. Ces grappes grossissent à mesure que l’infection progresse.
Les points lacrymaux à l’échelle nanométrique sont présents tout au long de l’infection, généralement distincts du RE, et apparaissent à la fois dans leur luminosité et leur taille pour contenir chacun une copie d’ARNg. Étant donné que les protéines de pointe virales ne sont pas colocalisées avec ces points, il est peu probable qu’il s’agisse de virions.
En fait, la pointe et l’ARNg se trouvent dispersés sur la membrane ER. Cependant, la protéine de pointe est intégrée dans la membrane pour être assemblée dans le virion, alors que l’ARNg se trouve principalement dans le RE, qui est situé dans le cytoplasme.
Pris ensemble, l’ARNg semble traverser de l’autre côté pour se lier à la surface droite et commencer l’assemblage du virion. L’assemblage du virion est un processus lent par rapport à la synthèse des protéines virales et de l’ARNg. De plus, les virions sont exportés rapidement une fois assemblés, ce qui explique leur incapacité à les détecter au sein de la cellule.
« Ainsi, nous pensons que l’étape limitante est l’ARNg cytoplasmique trouvant la membrane virion naissante parsemée des protéines requises incorporées dans la membrane, un processus qui dépend de la diffusion ainsi que des protéines de liaison à l’ARN requises..”
Les plus grands points d’ARNdb sont probablement contenus dans des vésicules à double membrane (DMV) et augmentent en nombre avec la progression de l’infection, mais avec une distribution de taille constante. Ceux-ci n’ont pas été trouvés en association avec les membranes ER et représentent plutôt probablement des DMV en herbe et déjà formés.
Fait intéressant, l’ARNdb à l’intérieur des DMV a échappé au marquage par le marqueur de protéine membranaire ER utilisé ici, ce qui peut indiquer que l’infection virale modifie les caractéristiques de la membrane. Alternativement, les DMV peuvent être trop courbés ou la membrane trop étroitement emballée avec des protéines virales pour permettre le marquage.
Les grands clusters d’ARNg ont été décorés à la périphérie par des ARNdb à l’échelle nanométrique mais ne se sont pas colocalisés. Cela pourrait être dû au fait que ces deux formes d’ARN se localisent dans des compartiments différents pour le stockage. En conséquence, l’ARNg devient inaccessible aux sondes une fois qu’il s’hybride pour former l’ARNdb.
Une autre explication potentielle est que les formes intermédiaires et finales de l’ARNg sont stockées séparément pendant le stockage, ou que les DMV ne contiennent que de l’ARN sous-génomique (ARNsg) sous forme d’ARNdb. Une dernière explication potentielle est que la réplication active se produit au point d’ARNdb, tandis que l’ARNg répliqué s’éloigne de ces sites en formant des grappes d’ARNg.
Les chercheurs ont également pu mesurer en termes quantitatifs la réponse du virus au traitement antiviral. Alors que le remdesivir réduisait le signal de l’ARNdb et de l’ARNg, il réduisait également la taille des gros clusters mais augmentait la taille du point ponctué d’ARNdb.
« La réplication active de l’ARN se produit dans la membrane alambiquée où l’ARNg forme des grappes. Les DMV, pourraient être un espace de stockage temporaire pour les intermédiaires de réplication d’ARN avant que le prochain virion puisse être emballé.”
Conséquences
Les résultats de l’étude actuelle démontrent les avantages de l’utilisation de l’imagerie à super-résolution de fluorescence (SR) multicolore pour comprendre comment les virus interagissent avec les cellules hôtes au niveau des protéines à l’échelle nanométrique. Bien qu’appliquée ici à un coronavirus saisonnier, cette méthode peut également être utilisée avec d’autres coronavirus, ainsi que pour tester des médicaments dans des systèmes à haut débit.
« Notre approche fournit un cadre d’imagerie complet qui permettra de futures enquêtes sur la biologie fondamentale du coronavirus et ses effets thérapeutiques. De manière générale, nous prévoyons que les efforts futurs appliqueront des techniques d’imagerie SR avancées en 3D ainsi que la combinaison de l’imagerie d’une seule molécule et de la tomographie cryo-électronique pour obtenir simultanément une résolution nanométrique et une spécificité moléculaire exquise pour la recherche en virologie..”
