L’émergence du syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) en décembre 2020 a conduit à une épidémie mondiale de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) qui a fait plus de 6,2 millions de morts en avril 2022.
On s’attendait à ce que le développement de vaccins aide à supprimer la propagation du virus, mais la réticence à la vaccination associée à l’apparition de variantes d’évasion immunitaire a démenti cet espoir.
Cela a donné un nouvel élan à la recherche d’antiviraux nouveaux ou réorientés ayant une activité contre ce virus.
Un nouvel article, paru dans la revue Médicamentsdécrit le développement de nouvelles molécules à activité inhibitrice contre l’enzyme protéase virale principale (Mpro), à base de venin de serpent à sonnette.
Introduction
La recherche d’un antiviral comprend la nécessité de s’assurer que le composé est sûr, bien toléré et peut agir contre de nouvelles variantes du virus. Les antiviraux antérieurs comme le remdesivir, le favipiravir et la combinaison lopinavir/ritonavir n’ont pas montré beaucoup d’efficacité contre le SRAS-CoV-2 dans des conditions réelles.
Après avoir infecté la cellule hôte, le SRAS-CoV-2 produit deux grandes polyprotéines à partir de son génome d’acide ribonucléique (ARN). Ceux-ci sont ensuite clivés en un certain nombre de protéines non structurelles par le Mpro viral et d’autres protéases virales, pour faciliter la réplication et la transcription. Cela conduira éventuellement à la production, à l’assemblage et à la libération de nouveaux virions.
Le Mpro, également appelé 3CLpro, est une protéase à cystéine, existant sous la forme homodimérique avec une dyade catalytique non canonique Cystéine-Histidine (Cys-His) dans la fente entre deux de ses trois domaines. Cette enzyme n’a pas d’homologues humains proches et est essentielle au cycle de vie viral. Cela en fait un bon choix pour les cibles de médicaments antiviraux.
Les peptides antimicrobiens (AMP) ont été une riche source de candidats-médicaments potentiels pour contrer les virus et autres microbes pathogènes. Les PAM sont utilisés pour plusieurs maladies liées aux virus, telles que Zika, la dengue et la grippe A. L’une d’entre elles est la crotamine.
La crotamine est un petit polypeptide présent dans le venin du serpent à sonnette d’Amérique du Sud, Crotalus durissus terrificus. Ce peptide peut pénétrer la paroi cellulaire et est hautement bioactif, principalement en raison de ses propriétés de surface cationiques. Il est particulièrement spécifique dans son attaque contre les cellules à multiplication rapide et fait partie de la catégorie des nouveaux nanoporteurs de polypeptides pénétrant dans les cellules (CPP).
Comme les autres CPP, il entre dans les types de cellules cibles en 5 minutes. Dans la présente étude, la petite séquence peptidique Crot_27–39 (dérivé de la crotamine L-peptide-1, L-CDP1) sous forme modifiée, et ses dérivés D, ont été étudiés pour leurs propriétés inhibitrices contre le SARS-CoV-2 Mpro.
Dans le premier ensemble de modifications, les résidus de cystéine ont été convertis en résidus de sérine à d’autres positions. Étant donné que les résidus de cystéine sont difficiles à modifier sans modifier entièrement la composition protéique et que la cystéine ressemble à la sérine dans tous les atomes sauf un, ils ne modifient que le groupe thiol de la cystéine. Cela préservait l’intégralité de la charge cationique de la crotamine et donc sa capacité à pénétrer dans les cellules par modification membranaire.
Résultats
L-CDP1 ainsi que ses modifications, telles que les peptides L-CDP2, L-CDP7 et L-CDP8, se sont avérés inhiber plus de 80 % de l’activité de Mpro de manière dose-dépendante. Alors que la crotamine inhibait complètement l’enzyme à une concentration de 300 µM, avec une concentration inhibitrice semi-maximale (CI50) de 40 µM, la L-CDP1 produisait une inhibition complète à 30 µM, la CI50 étant > 2 µM.
L-CDP2, où toutes les cystéines ont été remplacées par de la sérine, et l’IC50 est monté à 5 µM. Avec la cystéine en position 36, la substitution conduit à la formation de LCDP-7, qui est plus efficace à l’inhibition. L-CDP-7 et L-CDP-8 avaient une IC50 de 1,5 uM, avec une inhibition complète à 60 uM.
Une analyse plus approfondie a montré que des changements conformationnels se produisent avec la substitution de la cystéine. Les trois principaux inhibiteurs, à savoir les peptides L-CDP1, L-CDP7 et L-CDP8, se sont avérés être des inhibiteurs compétitifs, interagissant avec les acides aminés au site de catalyse ou au site de liaison au substrat, pour bloquer l’entrée du substrat au site actif.
La plus grande efficacité de liaison pour Mpro a été observée avec le récepteur L-CDP1. La substitution de la cystéine à la sérine a entraîné la perte d’un groupe soufré et le gain d’un groupe hydroxyle, modifiant la structure secondaire de la protéine et son interaction avec la protéase. Le résidu cystéine est donc la clé de l’entrée du peptide dans la cellule et de l’inhibition de Mpro.
Les énantiomères D, formés pour échapper à la dégradation de ces peptides par les enzymes endogènes, sont moins immunogènes et plus biodisponibles que les formes L. Leurs valeurs IC50 ont légèrement augmenté, mais elles ont produit le même type d’inhibition compétitive que les formes L. Pour D-CDP1 et D-CDP7, les valeurs IC50 étaient de 5 et 2 µM, respectivement.
Il est important de noter qu’aucun encombrement stérique n’a été observé. De plus, D-CDP1 interagit avec Mpro environ dix fois plus fortement que D-CDP7, comme avec les formes L. Ces composés n’ont pas montré d’inhibition basée sur l’agrégation et sont restés stables dans le temps, produisant une inhibition constante de l’enzyme sur 24 heures.
Aucun des énantiomères D n’était cytotoxique aux valeurs de CI50. In vitro les analyses ont montré que les deux inhibaient la réplication du SRAS-CoV-2 en culture cellulaire, entraînant une double réduction de l’ARN viral. Ceci n’est pas cliniquement significatif mais indique que ces composés possèdent une activité antivirale dans les cellules infectées, inhibant spécifiquement la réplication virale.
L’analyse de la représentation structurale de ces composés a montré que la substitution de la sérine à la cystéine modifie les interactions entre les peptides et l’enzyme puisque la cystéine forme des liaisons hydrogène avec le tryptophane dans le peptide, responsable en partie de sa structure secondaire. Ces résidus dans L-CDP1 correspondent aux poches de liaison de l’enzyme.
Avec L-CDP7, d’autres résidus tryptophane continuent de participer à la liaison sur d’autres sites, montrant que le site S2 primaire préfère les acides aminés aromatiques. Ces deux composés s’intègrent bien dans le site de liaison de l’enzyme Mpro.
Conséquences
Le criblage de composés dérivés du venin de serpent à sonnette a fait apparaître des peptides cationiques aux propriétés de pénétration cellulaire élevées. En tant que D-énantiomères, ils sont très stables, sélectifs et spécifiques de l’enzyme Mpro.
Des recherches supplémentaires seront nécessaires pour confirmer que le site d’action de ces composés est bien l’enzyme Mpro, leur mode d’action et la composition optimale de chaque peptide. Cela pourrait conduire au développement de composés thérapeutiques contre le SRAS-CoV-2 et les coronavirus apparentés.
