Une partie de l'ARN viral du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) est hautement conservée. Les chercheurs l'ont utilisé comme cible pour concevoir des gapmers oligonucléotidiques antisens pour cliver l'ARN et interrompre la réplication du virus. Leur recherche est publiée sous forme de pré-impression sur le serveur en ligne bioRxiv* en septembre 2020.
La propagation du COVID-19 causée par le SRAS-CoV-2 a conduit au développement de différentes méthodes de lutte contre la pandémie. Plusieurs types de vaccins sont à différents stades d'essais. D'autres études ont cherché à savoir si des médicaments approuvés pour d'autres maladies (médicaments réutilisés) pourraient être utiles comme traitement de la maladie COVID-19. Une autre approche consiste à développer de nouvelles méthodes pour perturber la réplication virale du SRAS-CoV-2.
Le virus SARS-CoV-2 est un virus à ARN simple brin. Le virus se réplique à l'intérieur de la cellule hôte à l'aide d'enzymes, qui sont codées par le virus. Le génome viral comporte également de nombreux éléments structurels dont les fonctions restent largement inconnues.
Un de ces éléments est le motif tige-boucle 2 (s2m), une séquence hautement conservée dans le Sarbécovirus genre, qui comprend le SARS-CoV et le SARS-CoV-2. Le s2m est presque identique dans ces deux virus, avec seulement une différence de 2 nucléotides et est toujours présent dans les échantillons prélevés sur des patients qui ont été testés positifs pour le SRAS-CoV-2.
Parce que le s2m est hautement conservé, avec une faible probabilité de mutation, les chercheurs pensent qu'il s'agit d'une cible prometteuse pour le développement d'antiviraux.
s2m est un élément structurel conservé dans le génome du SRAS-CoV-2. (A) Alignement de séquence de l'élément s2m dans les 3ʹ UTR de SARS-CoV-2 et SARS-CoV. (B) La structure cristalline de l'élément SARS-CoV s2m (adapté de Robertson et al., 2005). (C) Sondage chimique du 3ʹ UTR du SRAS-CoV-2. L'ARN a été dénaturé et replié en présence de 100 mM K + et 0,5 mM Mg2 +, puis incubé avec NAI (canal + NAI) ou contrôle DMSO (canal -NAI). La modification de NAI a été détectée par blocage de la transcription inverse et analyse sur gel. Des voies de séquençage ont été générées en ajoutant ddT (pour A), ddG (pour C), ddC (pour G) et ddA (pour U) lors de la transcription inverse. Le panneau inférieur montre la quantification du signal SHAPE dans les régions s2m et flanquantes. Le calcul était basé sur le gel de la figure 1C, en soustrayant le signal de la voie + NAI de celui de la voie -NAI. Le panneau supérieur montre l'annotation du signal SHAPE sur la structure s2m. Les bases avec un signal SHAPE de 0-0,2, 0,2-0,5, 0,5-0,8 et 0,8-2 ont été colorées respectivement en vert, jaune, orange et rouge.
Concevoir des gapmers et in vitro essai
Dans la nouvelle étude, une équipe internationale de chercheurs a utilisé des oligonucléotides antisens (ASO) d'acide nucléique verrouillé (LNA) pour cibler l'élément s2m. Les ASO sont une séquence de désoxyribonucléotides monocaténaires complémentaires de la cible. LNA est un type d'ASO où la liberté conformationnelle des nucléotides est «verrouillée». Une version de ces types de LNA ASO est le gapmer, où les bases LNA sont présentes aux bords d'une séquence d'ADN centrale. L'ADN central utilise ensuite la ribonucléase H (RNase H) pour cliver l'ARN, tandis que le gapmer reste intact et peut se lier à d'autres molécules d'ARN.
Tout d'abord, l'équipe a étudié la structure de l'élément s2m et a conclu que la structure se replie en une structure tige-boucle.
Étant donné que la structure cible est pliée, ils ont conçu des bases LNA gapmer pour se lier aux bases exposées de s2m, ce qui, après la liaison initiale, peut conduire au dépliage de s2m alors que le reste du gapmer se lie aux nucléotides complémentaires. Les gapmers 1-3 ont été conçus pour avoir une affinité plus élevée pour l'ARN cible que les gapmers 4-6.
Tester les gapmers conçus in vitro, l'équipe a constaté que tous les 6 gapmers dégradaient l'ARN s2m, même lorsque deux fois le nombre de molécules d'ARN pour chaque molécule gapmer, indiquant que les gapmers étaient réutilisés.
Ils ont également examiné la structure de l'élément s2m en présence des gapmers en utilisant une technique qui détermine dans quelle mesure les nucléotides sont accessibles. Lorsque les gapmers 1 et 2 étaient présents, les interactions intermoléculaires augmentaient entre les gapmers et les séquences cibles, et ces régions ressemblaient davantage à des simples brins. «Ainsi, les interactions intermoléculaires entre les gapmers et les régions cibles pourraient également remodeler le statut de repliement des régions flanquantes», écrivent les auteurs.
Les gapmers inhibent la réplication dans les cellules humaines
Pour tester l'effet des gapmers dans les cellules humaines, les chercheurs ont utilisé des cellules rapporteurs HeLa et A549 dérivées des poumons avec des protéines fluorescentes vertes (GFP).
En présence des gapmers 1-3 et gapmers 5-6, la fluorescence de la GFP a diminué, indiquant une inhibition de la réplication. Gapmer 4, qui n'avait que six nucléotides, n'a montré aucun effet, suggérant qu'il pourrait être trop court pour recruter la RNase H humaine in vivo.
Les astrovirus sont un autre type de virus à ARN simple brin qui ont également la structure s2m. L'équipe avait précédemment développé un système de réplicon basé sur l'astrovirus humain 1 (HAstV1), qu'ils ont maintenant modifié pour inclure l'élément SARS-CoV-2 et SARS-CoV s2m, pour tester leurs gapmers. Étant donné que le système de modèle d'astrovirus a une taille de génome plus petite que le coronavirus, il est plus facile à étudier.
Les écarteurs 1, 2 et 5 ont inhibé efficacement la réplication des réplicons avec la structure SARS-CoV-2 s2m, à des concentrations sub-nanomolaires. L'inhibition de la réplication à l'aide des gapmers 3, 4 et 6 était moins prononcée.
Un point à noter, écrivent les auteurs, est que l'ARN viral du SRAS-CoV-2 est dissimulé dans des matériaux de type membrane dans la cellule hôte. Cela peut empêcher les ASO d'atteindre l'élément s2m du virus. Par conséquent, les gapmers qui améliorent l'association avec les membranes cellulaires peuvent les aider à atteindre l'ARN. Les LNA ASO ont été conjugués avec du tocophérol et du cholestérol avant pour aider à la liaison membranaire. De telles conceptions peuvent aider l'association membranaire, aidant les ASO à atteindre l'ARN.
Les auteurs disent que ces résultats sont prometteurs pour continuer à tester le gapmer et d'autres stratégies basées sur ASO pour inhiber la réplication de l'ARN dans le SRAS-CoV-2. Cependant, des tests et une optimisation supplémentaires seront nécessaires pour élaborer des traitements efficaces, y compris des tests sur des cultures cellulaires et des modèles animaux.
*Avis important
bioRvix publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.
