Alors que la pandémie de COVID-19 continue de se propager dans de nombreuses régions du monde, il y a un besoin urgent d'un vaccin préventif et de traitements améliorés. Une nouvelle étude menée par des chercheurs du NYU Langone Medical Center et du Weill Cornell Medical College et publiée sur le serveur de pré-impression bioRxiv * en septembre 2020 rapporte le potentiel d'un complexe Fc-anticorps de l'enzyme de conversion 2 (ACE2) de l'angiotensine dans un nouveau format qui semble offrir une inhibition plus significative du SRAS-CoV-2.
L'ACE2 a été l'une des principales cibles thérapeutiques et de développement de vaccins en raison de son rôle intrinsèque dans l'attachement viral via la glycoprotéine de pointe et son entrée dans la cellule hôte. Le blocage de cette première étape pourrait empêcher complètement l'infection et constitue une intervention facile en raison de l'emplacement de la cible sur la surface de la cellule, ce qui évite la nécessité d'une entrée dans la cellule.
Sommaire
Récepteurs ACE2 solubles
Les premières recherches ont examiné l'utilisation de récepteurs solubles pour le VIH-1, car la liaison virale aux récepteurs CD4 via la glycoprotéine d'enveloppe gp120 inhibe de manière compétitive son attachement au récepteur cible des lymphocytes T CD4, empêchant ainsi l'entrée virale. Des études in vitro ont confirmé ce mécanisme d'inhibition virale.
Lorsque la protéine a été fusionnée à la partie Fc d'une molécule d'immunoglobuline, pour former une immunoadhésine, des dimères de gpl20 se sont formés, avec une avidité significativement accrue. Il a été démontré, in vivo, que cela se traduisait par une durée plus longue de la survie des protéines dans le corps.
Les protéines microbrosses de type sauvage et H345A ACE2 sont des dimères à liaison disulfure. (A) Les domaines de ACE2 sont présentés avec les structures des protéines de micro-corps ACE2 (sACE2), ACE2 et ACE2.H345A ci-dessous. Les protéines ACE2 solubles sont délétées pour les domaines transmembranaire (TM) et cytoplasmique. Les protéines micro-corps ACE2 sont fusionnées au domaine CH3 IgG humain chacune avec un marqueur carboxyterminal 8XHis. IC: domaine intracellulaire.
Plus tard, une autre modification a été apportée, avec l'ajout d'un corécepteur viral CCR5-dérivé de peptide à l'immunoadhésine CD4-Ig. Cela s'est avéré être un inhibiteur viral puissant, protégeant contre l'infection chez les modèles animaux.
Le présent article traite d'une approche similaire des récepteurs solubles pour bloquer l'entrée du SRAS-CoV-2, basée sur la protéine ACE2 soluble humaine recombinante (hrsACE2) ou hrsACE2-IgG, qui a l'ACE2 lié à l'Ig-Fc. Il a été montré plus tôt que les deux prévenaient l'infection par le SRAS-CoV et le SRAS-CoV-2 dans un modèle murin.
Dans les essais cliniques de phase 1 et de phase 2, cette protéine a montré un blocage partiel de l'activité virale mais a été rapidement retirée de la circulation. La demi-vie s'est améliorée in vivo avec l'ajout de la partie Fc. Cependant, cela soulève des inquiétudes quant aux risques de maladie grave due à une amélioration dépendante des anticorps en raison de la présence du Fc. Le récepteur Fc se produit naturellement sur les cellules immunitaires et est le site de fixation de l'anticorps anti-spike, conduisant à une augmentation de l'entrée virale dans ces cellules.
Protéine ACE2 Microbody
Pour éviter cela, les chercheurs actuels ont exploré l'utilisation d'un «micro-corps» ACE2 humain soluble dans lequel la molécule ACE2 est fusionnée à la chaîne lourde Ig Fc via l'ectodomaine de la première. L'ectodomaine préserve les résidus cystéine, permettant la formation de dimères protéiques, avec une plus grande affinité de liaison pour le virus, même en réduisant sa masse moléculaire. Les dimères ACE2 solubles et les dimères micro-corps ACE2 sont maintenus ensemble par des liaisons non disulfure et disulfure.
Les chercheurs ont découvert que ce micro-individu n'a pas réussi à se lier au récepteur Fc à la surface des cellules immunitaires et, par conséquent, ne donnerait pas lieu à l'ADE. L'activité antivirale du micro-corps était dix fois plus élevée que celle de l'ACE2 soluble, bien que les deux soient des dimères. Il avait également une plus grande affinité pour la liaison aux virions. En culture tissulaire, il a persisté plus longtemps que l'ACE2 soluble.
Il a également bloqué l'entrée du virus sur une gamme de lignées cellulaires, pour la variante de pointe d'origine et la variante dominante D614G, ainsi que d'autres dans un panel de protéines de pointe de bêta-coronavirus.
Prévention de l'activité catalytique ACE2
Les chercheurs ont découvert que l'introduction d'une mutation H345A spécifique afin d'empêcher l'ACE2 soluble d'exercer son activité enzymatique catalytique n'avait pas d'impact sur son affinité pour la protéine S. Ceci est nécessaire pour éviter ses effets sur la pression artérielle.
Le pseudovirus incorpore le DS avec une infection accrue
Les pseudovirus exprimant un mutant de délétion de la protéine de pointe qui supprime la séquence de rétention ER putative qui empêche la migration de la protéine S vers la surface cellulaire avaient des niveaux de protéine S 20 ou plus supérieurs à ceux qui exprimaient la protéine S pleine longueur. Le nombre de virions était cependant similaire. On pense que la raison de l'augmentation de l'efficacité de l'empaquetage DS est la perte d'inhibition de la queue cytoplasmique ER lors de l'incorporation de S dans le virion puisque les deux sont presque également exprimés à la surface cellulaire.
Les chercheurs ont également découvert que les pseudovirus exprimant la protéine S se liaient spécifiquement aux protéines de micro-corps ACE2 solubles. Cette liaison a été inhibée par du sérum humain en convalescence avec un titre d'anticorps élevé. Le micro-corps mutant ACE2 (à la fois de type sauvage et soluble) s'est lié aux virions plus efficacement que la protéine de micro-corps de type sauvage, même si l'acide aminé muté n'est pas à la surface, qui interagit avec la protéine de pointe.
ACE2 Microbody bloque l'infection à pseudovirus SRAS-CoV-2
Les chercheurs ont examiné la capacité de l'ACE2 soluble et du micro-corps ACE2 à empêcher la réplication du pseudovirus SRAS-CoV-2 DS, en utilisant un marqueur colorant fluorescent. Ils ont constaté que si l'ACE2 soluble avait une activité antivirale modérée, le micro-corps était beaucoup plus puissant, tandis que le micro-corps muté avait une activité inhibitrice très puissante. La concentration antivirale efficace CE50 était de 1,24 μg / ml, 0,36 μg / ml et 0,15 μg / ml pour l'ACE2 soluble, le microcorps ACE2 et le microcorps ACE2 muté, respectivement.
L'activité de l'ACE2 soluble est similaire à celle du sérum de convalescence et inhibe explicitement la protéine de pointe du SARS-CoV-2.
Ils ont infecté une lignée cellulaire avec le SRAS-CoV-2 modifié vivant contenant un gène marqueur de colorant fluorescent dans ORF7 afin que sa réplication puisse être surveillée. Ils ont constaté qu'à des dilutions en série, le micro-corps ACE2 conservait une activité antivirale de 1 à 0,125 μg. Avec ACE2 soluble, avec une CE50 de 1 μg, l'activité a été perdue à 0,5 μg. Les microbulles ACE2 de type sauvage et mutés ont montré ici une CE50 similaire, étant supérieure à ACE2 soluble.
Ils ont ensuite déterminé que les protéines de la micro-personne seraient également actives lorsqu'elles seraient exposées au virus à des moments ultérieurs, les premières étant ajoutées simultanément ou jusqu'à 6 heures après l'infection. Ceci a abouti à une inhibition de 80% lorsque les deux ont été ajoutés simultanément, presque la même chose à 30 minutes de l'infection et 55% à 2 heures quand environ 10% du virus infectieux est lié à la cellule. L'activité a diminué après cela.
Ainsi, la micro-personne ACE2 peut bloquer l'infection si elle est présente avant la liaison du virus à la cellule cible, ou au moment de l'exposition, et même jusqu'à 2 heures après l'exposition. Cette fenêtre de temps indique la période pendant laquelle le virus ne s'est pas encore lié de manière significative à la cellule.
De plus, même peu de temps après la liaison du virus, les taux d'infection pourraient être abaissés en incubant avec la micro-personne ACE2 pendant les 30 minutes suivantes. Le taux de liaison du virus au récepteur ACE2 s'est avéré dépendant du temps, avec beaucoup plus de liaison à 4 heures par rapport à 1 heure d'incubation, peut-être parce que seules quelques interactions pic-ACE2 se produisent au début, suivies par l'entrée de protéines S supplémentaires. dans la reliure au fil du temps. Au fur et à mesure que ce dernier se produit, les microrganismes ACE2 ne sont plus capables d'inhiber l'entrée virale.
Blocs de micro-personne ACE2 Variante D614G
Un variant de SARS-CoV-2 contenant une mutation ponctuelle D614G dans la protéine S est connu pour devenir le variant dominant partout où il émerge rapidement. Il est associé à une infectivité accrue. Le pseudovirus DS contenant cette mutation est également bloqué modérément par ACE2 soluble, tandis que les micropubes ACE2 de type sauvage et mutant sont plus puissants pour inhiber la réplication virale avec ce variant. Une comparaison des deux types de pseudovirus concernant la liaison a montré que l'ACE2 soluble se lie plus efficacement au variant porteur du pic D614G, tandis que
ACE2 Microbody se lie à d'autres protéines de pic de bétacoronavirus
Les protéines micro-corps ACE2 et H345A ont empêché l'entrée de tous les pseudovirus porteurs de différentes protéines de pointe de bétacoronavirus, indiquant un large spectre d'anti-bétacoronavirus tandis que l'ACE2 soluble avait une activité antivirale inférieure.
Implications
Le microbody ACE2 est 10 fois plus actif que l'ACE2 soluble contre le SARS-CoV-2 et a une affinité quatre fois plus importante pour les particules virales. Son origine humaine signifie que son immunogénicité est faible. Il semble également avoir une large efficacité contre les variantes de pointe émergentes, y compris la mutation D614G.
Les chercheurs ont introduit une mutation spécifique dans le micro-corps ACE2 pour éliminer l'activité catalytique de l'enzyme tout en préservant son activité antivirale. Cette mutation a semblé augmenter l'activité du micro-corps mais pas son potentiel d'inhibition dans le test de virus vivant.
Les chercheurs suggèrent également que le microdyne pourrait avoir une activité antivirale plus importante que celle observée ici car la plupart des expériences ont été menées sur des cellules qui expriment des niveaux élevés d'ACE2. Lorsqu'il est dosé sur une lignée cellulaire avec des niveaux d'ACE2 très bas, le micropoutu ACE2 avait plus d'activité antivirale.
Les enquêteurs résument: «La protéine micro-personne ACE2 à liaison disulfure a inhibé l'entrée du virus pseudotypé de la protéine de pointe du SARS-CoV-2 lentivirale et du SRAS-CoV-2 vivant avec une puissance 10 fois supérieure à celle de l'ACE2 soluble non modifié et était active après la liaison initiale du virus à la cellule. »
L'étude montre également que la protéine D614G S confère une plus grande infectivité et une plus grande affinité pour ACE2. Cependant, le micro-corps ACE2 a pu neutraliser le pseudovirus contenant ce variant de pointe, ainsi que d'autres protéines de pointe de bétacoronavirus. Cela pourrait indiquer que cette technologie peut être utilisée pour neutraliser les nouveaux coronavirus émergents qui se lient également au récepteur ACE2, permettant son utilisation comme « un réactif du commerce qui pourrait être déployé rapidement. »
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas examinés par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
