Dans une étude récente publiée dans eBioMedicine, les chercheurs ont développé la plateforme microfluidique flexible, robuste et sans équipement (FREM) pour le dépistage du paludisme et le génotypage des espèces de Plasmodium.
Étude: Une plateforme microfluidique polyvalente pour le dépistage des infections palustres et le génotypage des espèces de Plasmodium. Crédit d’image : nechaevkon/Shutterstock.com
Sommaire
Arrière-plan
Le paludisme, un problème de santé mondial causé par l’espèce Plasmodium, nécessite une détection et un génotypage précis pour être contrôlé efficacement. La principale technique de diagnostic est le test d’amplification des acides nucléiques ; cependant, leur déploiement généralisé pose des obstacles dans des contextes aux ressources limitées.
Les systèmes CRISPR/Cas ont transformé le diagnostic moléculaire, mais ils nécessitent souvent deux étapes indépendantes, compliquant les procédures et empêchant une mise en œuvre générale.
L’utilisation de systèmes limités soulève des difficultés de biocompatibilité et la possibilité de réduire l’efficacité de la détection. Un typage génétique précis est essentiel aux efforts de traitement et de contrôle du paludisme.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont évalué l’efficacité de la plateforme microfluidique pour le dépistage et le dépistage simultanés du paludisme. Plasmodium génotypage.
Pour le dépistage de l’infection par le paludisme et Plasmodium génotypage, la plate-forme microfluidique combinait l’amplification de la recombinase polymérase (RPA) avec une détection basée sur des répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR).
Les chercheurs ont créé des candidats ARN CRISPR (ARNcr) universels et spécifiques à l’espèce pour cinq Plasmodium espèces, chacune avec un motif adjacent protospacer (PAM) pour reconnaître Cas12a. Des échantillons de sang ont été prélevés sur tous les sujets et les réactifs RPA ont été mélangés avec du saccharose dans un tube avant d’être administrés aux appareils CRISPR.
L’ARNr ciblant les séquences conservées de Plasmodium a été utilisé pour les tests d’infection par le paludisme. Dans chaque expérience médiée par Cas12a, cinq ARN CRISPR ciblant des loci distincts de Plasmodium falciparum, Plasmodium paludisme, Plasmodium ovale, Plasmodium vivaxet Plasmodium savoir ont été utilisées. Un système microfluidique capable d’évaluer six cibles en tandem a été utilisé pour réaliser le diagnostic du paludisme.
Une puce microfluidique mesurant 7,2 mm (hauteur) sur 26 mm (diamètre) a été créée à l’aide d’une imprimante tridimensionnelle pour réaliser une détection multiplex. Les systèmes Cas12a (n = 6) ont été placés dans leurs chambres respectives, chacune hébergeant des ARN CRISPR distincts pour Plasmodium et d’autres espèces.
Quatre-vingt-dix litres de solution d’amplification de la recombinase polymérase ont été injectés dans l’orifice d’admission central et distribués uniformément dans les chambres périphériques à travers des tubes capillaires.
L’activité de clivage de Cas12a a été engagée lors de l’identification spécifique de l’ARN CRISPR aux amplicons d’amplification de la recombinase polymérase, donnant un signal fluorescent ou colorimétrique pour différencier les cas de paludisme positifs.
La puce microfluidique a été photographiée à l’aide d’appareils photo de smartphone après exposition à la lumière d’une diode électroluminescente bleue (DEL).
Les acides nucléiques utilisés dans les tests FREM ont été utilisés pour la réaction en chaîne par polymérase et le séquençage afin de cribler et de catégoriser Plasmodium espèces dans les échantillons cliniques de DBS. Une électrophorèse sur gel d’agarose à deux pour cent a été utilisée pour évaluer les résultats de la réaction en chaîne par polymérase (PCR).
Résultats
Plusieurs espèces de Plasmodium ont été détectés à l’aide de la puce microfluidique, amplifiés à l’aide d’amorces d’amplification universelles de la recombinase polymérase et génotypés à l’aide d’ARNc particuliers. La combinaison de RPA et de CRISPR a permis d’identifier efficacement les acides nucléiques cibles.
Une solution de saccharose a séparé les tests CRISPR et RPA dans un seul pot, atténuant ainsi les problèmes de compatibilité.
Les chercheurs ont réalisé l’expérience en un seul pot avec et sans solution de saccharose, comparant l’efficacité en évaluant les intensités des signaux de fluorescence au point final et en temps réel.
La réaction en un seul pot avec des amorces supérieures à 400 nM a atteint un plateau après 60 minutes, avec une variation minimale des performances de détection entre 38-42 °C et 38 °C, qui a été déterminée comme étant la température de fonctionnement idéale pour FREM.
La sensibilité de détection de la réaction en un seul pot (102 copies/L) était dix fois inférieure à celle de l’approche en deux étapes. La limite de détection (LOD) de la puce était équivalente à la lecture du signal fluorescent à base de tube.
L’analyse de l’alignement de séquences multiples (MSA) a révélé que les emplacements cibles étaient conservés parmi les espèces de Plasmodium. Le dispositif microfluidique a produit une stratification efficace et a renforcé la résilience de la plateforme.
L’évaluation clinique d’extraits d’acide désoxyribonucléique provenant d’individus suspectés de paludisme a révélé que la plateforme microfluidique avait une plus grande sensibilité (98 %) et une plus grande spécificité (93 %), produisant des résultats similaires avec le séquençage par réaction en chaîne par polymérase pour diagnostiquer le paludisme.
Des valeurs de concordance de 91 % entre la plateforme microfluidique et le séquençage PCR ont été prouvées Plasmodium précision du génotypage. Les chercheurs ont découvert un ensemble de molécules d’amorce d’amplification de la recombinase polymérase présentant la meilleure efficacité pour amplifier un fragment génétique conservé provenant de cinq espèces.
La concordance globale du dépistage de l’infection paludique à l’aide de la plateforme microfluidique a atteint 99 % (153/154), combinant les résultats du séquençage PCR et de la qPCR.
Conséquences
D’après les résultats de l’étude, la plateforme microfluidique constitue une option potentielle pour une Plasmodium le dépistage des infections et le génotypage des espèces pour améliorer la lutte contre le paludisme et élargir son utilisation à d’autres infections.
Il utilise une solution à 10 % de saccharose et intègre les tests RPA et CRISPR dans un appareil monopot, simplifiant ainsi la procédure de diagnostic et garantissant une efficacité élevée.
Cette méthode est particulièrement utile pour détecter cinq Plasmodium espèces, améliorant la surveillance épidémiologique, influençant les décisions de traitement et transformant la prestation des soins de santé. La plateforme s’aligne sur l’objectif plus large d’éliminer le paludisme d’ici 2040.
