Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont effectué la cartographie photocatalytique des interactions protéine-cellule hôte du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2).
La compréhension de l’entrée virale et de la pathogénicité peut être améliorée en identifiant les habitats protéiques à l’interface virus-cellule hôte. Le virus responsable de la pandémie actuelle de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), le SRAS-CoV-2, utilise la protéine de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE2) comme récepteur primaire. Cependant, le rôle d’autres protéines cellulaires dans le processus d’entrée est incertain.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, l’équipe a développé une technologie de cartographie du microenvironnement de la protéine virale hôte (ViraMap) à l’aide de photocatalyseurs d’iridium (IrPC) conjugués à la protéine de pointe SARS-CoV-2 pour le marquage de proximité par lumière visible sur les cellules hôtes.
L’équipe a généré des conjugués de photocatalyseur de protéine de pointe pour un marquage ciblé sur les cellules exprimant l’ACE2 afin d’analyser les interactions dans le microenvironnement de surface de la cellule hôte-pointe du SRAS-CoV-2 à l’aide de ViraMap. Le trimère de protéine de pointe SARS-CoV-2 et ses variantes associées, y compris la pointe SARS-CoV-1 et la pointe SARS-CoV-2 D614G, ont été choisis pour la conjugaison avec IrPC.
En outre, les chercheurs ont effectué un marquage ciblé sur les cellules en les exposant à des conjugués spike-IrPC en présence d’une sonde biotine-diazirine. Cela a été suivi d’une irradiation à la lumière bleue et d’une surveillance ultérieure par cytométrie en flux et analyse d’imagerie confocale. Pour étiqueter sélectivement les contacts de surface de la cellule hôte et éviter l’internalisation cellulaire des conjugués spike-IrPC, les cellules HEK293T + ACE2 ont été traitées avec spike-IrPC à 4 ° C.
L’équipe a évalué la liaison à la surface cellulaire en présence de la protéine ACE2 libre pour établir que le composé spike-IrPC a conservé son affinité pour l’ACE2 (ACE2-Fc). Pour le marquage de proximité de la surface cellulaire sur les cellules HEK293T + ACE2, trois variantes de pointe-IrPC telles que les protéines de pointe SARS-CoV-1, SARS-CoV-2 et SARS-CoV-2 D614G ont été utilisées.
De plus, l’équipe a utilisé une combinaison d’anticorps primaire-secondaire comprenant un anticorps primaire anti-ACE2 et un conjugué anticorps-photocatalyseur pour un marquage ciblé. Après extraction de la fraction de membrane cellulaire et enrichissement en streptavidine, les protéines hôtes biotinylées de ces études de marquage ciblées ont été caractérisées quantitativement à l’aide d’une quantification par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS)/MS basée sur une étiquette de masse en tandem (TMT).
Résultats
Par rapport à un contrôle d’immunoglobuline G (IgG) d’anticorps non contraignant conjugué à IrPC, l’analyse par cytométrie en flux a révélé un changement clair du signal de biotinylation pour les cellules traitées avec des conjugués de variants spike-IrPC. Par rapport au contrôle souris-IgG-IrPC, l’imagerie confocale du marquage induit par le pic-IrPC a révélé la localisation de la biotine dans l’environnement de surface de la cellule hôte. De plus, étant donné que la construction de pointe recombinante avait une étiquette poly-His, la biotinylation cellulaire pourrait être obtenue par marquage ciblé avec un conjugué IrPC d’anticorps anti-His.
Les protéines de pointe SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, SARS-CoV-2 D614G conjuguées à l’IrPC, ainsi que les systèmes d’anticorps primaires/secondaires anti-ACE2 ont entraîné un enrichissement statistiquement significatif de groupes distincts de protéines cellulaires par rapport à l’IrPC conjugué d’isotype comme témoin négatif. À l’aide des algorithmes de notation SAINTexpress et des statistiques d’interaction de spectrométrie de masse (MiST), l’équipe a identifié 96 protéines enrichies de haute confiance dans toutes les études de marquage spike-IrPC.
Près de 23 des 96 protéines enrichies à haute confiance étaient partagées par les trois variantes de pointe, tandis que les deux, 25 et 46 protéines enrichies restantes étaient uniques au SARS-CoV-1, SARS-CoV-2 et SARS-CoV- 2 pointes D614G spike-IrPC, respectivement. L’analyse de l’enrichissement de l’ontologie génique des 23 protéines enrichies a révélé une relation significative avec l’entrée virale, suivie de la différenciation des cellules immunitaires et des activités de co-stimulation. De plus, 70 % des protéines enrichies avaient une forte abondance dans la plupart des tissus humains, y compris les poumons, les reins, le tractus gastro-intestinal, la graisse, le muscle cardiaque, les tissus mous, les tissus reproducteurs et le cerveau.
Sur 23, un total de 10 protéines enrichies à haute confiance pourraient être divisées en deux groupes selon qu’elles ont montré ou non un co-enrichissement avec le système d’anticorps primaire/secondaire anti-ACE2. La première classe de récepteurs de surface cellulaire comprenait l’ACE2, la neuropiline 1 (NRP1), le récepteur de la prostaglandine F2 négatif (PTGFRN) et la protéine 2 homologue de l’encoche du locus neurogène (NOTCH-2). La preuve de l’expression de la protéine PTGFRN et de l’acide ribonucléique messager (ARNm) dans un large éventail de cellules tissulaires, en particulier les cardiomyocytes et les fibroblastes pulmonaires, implique que ces types de cellules sont très sensibles au SRAS-CoV-2 via divers points d’entrée. Les galectines étaient le deuxième ensemble de protéines hôtes trouvées dans les trois tests de marquage spike-IrPC.
Les résultats des expériences de marquage ciblées indiquent des co-récepteurs putatifs de surface cellulaire impliqués dans l’entrée virale et l’immunité antivirale. En conséquence, des expériences fonctionnelles ont été réalisées pour évaluer lesquelles des protéines hôtes identifiées sont impliquées dans l’entrée du SRAS-CoV-2 dans les cellules. Pour la validation fonctionnelle, l’étude s’est concentrée sur les dix protéines se chevauchant partagées par les trois variantes de spike-IrPC. Les répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en cluster / knockdown médié par Cas9 (KD) n’ont réduit l’abondance d’ACE2 que de 30%. Bien qu’il y ait eu une réduction de 40 % de l’expression des protéines par rapport aux témoins, il n’y a eu aucun changement significatif dans l’entrée des pseudoparticules après NRP1 KD.
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que la technologie ViraMap a facilité avec succès l’évaluation des interactions virus-protéine hôte connues et inconnues qui se produisent sur la membrane cellulaire externe de la cellule hôte en utilisant des modalités de ciblage par reconnaissance de surface cellulaire.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
