Partout dans le monde, les scientifiques travaillent sans relâche pour développer des thérapies et des vaccins efficaces contre l'infection par le coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère.
Une nouvelle étude publiée sur le serveur de pré-impression bioRxiv* en octobre 2020 rapporte la découverte d'importantes caractéristiques génomiques virales qui sont cruciales pour sa réplication dans les cellules des voies respiratoires humaines, et ses mutations améliorantes qui augmentent le taux de réplication et déterminent ses cellules cibles.
Cette découverte suggère que la glycoprotéine de petite enveloppe (E) du SRAS-CoV-2 a des fonctions spécifiques importantes dans les cellules respiratoires humaines, ainsi que in vivo, et indique en outre que les résidus aux positions 5 et 6 jouent un rôle clé dans les activités E dans les cellules humaines.
Étude: Des phénotypes distincts d'isolats de SRAS-CoV-2 révèlent des traits viraux essentiels pour la réplication dans les cellules respiratoires humaines primaires. Crédit d'image: Orpheus FX / Shutterstock
Sommaire
Protéine virale et entrée cellulaire
Le virus gagne l'entrée dans la cellule hôte via sa glycoprotéine de pointe. Cette protéine de surface se lie à l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE2) de la cellule hôte en tant que son récepteur pour l'entrée cellulaire et la fusion membranaire. Ce dernier processus est vital pour son internalisation et dépend de la fonction d'une protéase hôte, qui clive le pic en ses deux sous-unités après l'attachement ACE2.
Le site de clivage de la furine à l'interface des deux sous-unités permet à la furine protéase d'amorcer la protéine de pointe à l'avance, améliorant ainsi l'efficacité de l'entrée virale par fusion.
D'autres protéines virales, telles que la membrane, la nucléocapside et les protéines d'enveloppe, ont leur propre signification structurelle et fonctionnelle. L'entrée du virus dans la cellule hôte déclenche la traduction de l'ARN génomique viral, par laquelle les protéines virales non structurales sont produites, à savoir nsp 1-16.
Complexe de réplicase virale-transcriptase
Parmi ceux-ci figurent les composants essentiels du complexe viral réplicase-transcriptase, ainsi que d'autres facteurs viraux qui permettent l'évasion immunitaire. Le complexe de réplication du coronavirus possède des gènes de relecteurs sophistiqués qui stabilisent le génome contre les erreurs, mais de nombreuses mutations ont déjà été publiées, malgré cette fonctionnalité. Certains sont associés à des avantages de réplication ou d'infectivité, tels que la mutation D614G dans la protéine de pointe, qui a amené les souches contenant à devenir rapidement dominantes.
Identifier les mutations via le passage
L'étude actuelle s'est concentrée sur 14 souches de SRAS-CoV-2 isolées de patients infectés lors de la première vague suisse de la pandémie. Ceux-ci provenaient des différents clades européens de la période (mars à mai 2020), et chacun avait ses propres départs génétiques. Avec un nombre limité de passages dans les cellules Vero et les cellules épithéliales bronchiques primaires humaines matures, de rares mutations supplémentaires sont également apparues.
Les chercheurs ont d'abord isolé le virus à partir d'échantillons prélevés sur des patients de la première vague, principalement de ceux avec un seuil de cycle bas. Le taux d'isolement de 62% à partir de 21 échantillons avec un Ct inférieur à 25, par rapport au 1 isolat de 46 échantillons avec Ct supérieur à 25 concorde avec les chiffres précédents du taux d'isolement du virus infectieux à partir de ces échantillons.
Ils ont constaté que les isolats représentaient les principaux clades européens de l'époque. Parmi les mutations induites par le passage, la plupart étaient dans S, E ou les protéines non structurales, avec différentes mutations émergeant malgré des conditions de passage similaires.
Dans 6/14 isolats, les résidus E ont été modifiés pendant la croissance dans les cellules Vero, mais seulement 2/14 ont montré une délétion du site de clivage de la furine lors du passage. Ce nombre de passages ici était faible, et d'autres substitutions se seraient probablement produites autrement.
Les chercheurs ont caractérisé ces isolats comme représentant les souches précoces, concernant leur adaptation et leur réplication chez l'hôte humain. Ils ont constaté que tous les isolats se développaient bien, avec quelques différences de taille de plaque. Les différences se sont intensifiées avec l'analyse de plusieurs cycles de croissance.
Cela a montré que la plupart des virus produisaient des titres finaux de 106 ou 107 unités formant plaque (PFU) en 72 heures, mais certaines ont subi une atténuation à des titres 10 ou 100 fois inférieurs. Certains ont également montré un taux de croissance plus lent.
Dans une culture de cellules épithéliales bronchiques humaines primaires, ils ont constaté que l'inoculation virale produisait des taux de croissance différents sur 72 heures. Sur les 14 isolats, 5 sont passés à plus de 107 PFU, mais deux étaient fortement atténués jusqu'à des titres 100 fois inférieurs. Deux n'ont pas du tout répliqué. Cinq d'entre eux ont montré une croissance intermédiaire, à des taux 10 fois inférieurs.
Facteurs déterminant l'efficacité de la réplication spécifique de la cellule hôte
Les chercheurs ont également découvert que si deux isolats présentaient une réplication tout aussi efficace dans les cellules Vero ou dans les cellules bronchiques, trois préféraient ces dernières, montrant une croissance très atténuée dans les cellules Vero. Chacun des trois présentait des résidus substituants combinés uniques dans ORF3a et nsp2. Les auteurs suggèrent que cela pourrait indiquer un lien entre ces changements et la spécificité de la cellule hôte.
Trois autres se sont répliqués avec une efficacité très élevée dans le premier mais pas dans le dernier, tous ayant des variants géniques en position 5 ou 6 de la protéine E. Une souche s'est développée très lentement dans ces dernières mais moyennement bien dans les cellules Vero, probablement parce que plus de 80% avaient une suppression du site de clivage de la furine.
Par conséquent, le virus est très spécifique par rapport à ses hôtes, le G614 montrant une plus grande efficacité de réplication que le D614. Les données de réplication montrent le lien de plusieurs acides aminés avec les phénotypes de la maladie, indiquant que ces résidus portaient des traits viraux nécessaires à une réplication efficace.
Prévalence globale des mutations fonctionnelles
L'étude montre que des variants dans ORF3a et nsp2 se produisent dans un cinquième des isolats même après le passage, ce qui correspond aux estimations mondiales. Les variants de position 5/6 dans la protéine E et la délétion du site de clivage de la furine dans la protéine de pointe étaient absents dans les échantillons mondiaux mais augmentaient lors du passage dans les cellules Vero. En d'autres termes, les variants d'isolat qui ont augmenté l'efficacité de réplication vers l'un ou l'autre des hôtes de culture ont été sélectionnés de manière positive lorsqu'ils sont passés dans des cellules Vero.
Le passage comparatif montre des traits fonctionnels
Le site de clivage de la furine se trouve dans des échantillons du monde entier mais peut être supprimé pendant le passage des cellules Vero. Les chercheurs ont découvert que le passage de quatre réplicats différents avec des fréquences différentes de ce site dans les deux types de cultures provoquait la réplication d'une souche dans les deux, à savoir la souche qui présentait la suppression dans ~ 24% des cas. La fréquence de suppression est généralement passée d'environ 20% à 50% à 80% dans le passage des cellules Vero. La délétion a été perdue lors du passage dans l'épithélium bronchique, chaque séquence récupérée montrant le site de clivage d'origine.
Le site de délétion s'est produit dans plus de 81% avec une autre souche, mais le virus a montré une réplication efficace dans les cellules Vero et a maintenu la délétion du site de clivage de la furine au même niveau. Dans l'autre type de cellule, il s'est développé très faiblement. Ce dernier, une fois séquencé, a montré une atténuation sévère et la suppression a été perdue.
Implications et orientations futures
Cette étude montre que le site de clivage de la furine est vital dans les cellules bronchiques. Cette étude comparative a montré le rôle clé joué par le site de clivage de la furine et les positions de la protéine d'enveloppe 5/6 pour décider de l'infectivité et de la réplication efficace du virus dans les cellules respiratoires humaines.
De plus, la mutation G614 était liée à une efficacité de réplication plus élevée par rapport à D614. Les pseudotypes précédents portant la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 ont montré une plus grande infectivité par rapport au variant d'origine. Ceci est soutenu par des études de génétique inverse. Les auteurs disent que cela aide à comprendre comment la mutation D614G a conduit à la propagation rapide du virus.
Troisièmement, les mutations naturelles ORF3a et nsp2 étaient liées au tropisme cellulaire, ces souches préférant les cellules bronchiques humaines pour une réplication efficace tandis que le reste présentait une mauvaise réplication dans les cellules Vero.
Ces variantes se produisent dans un cinquième de toutes les séquences mondiales, et des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre les fonctions du nsp2. Il peut être impliqué dans de nombreuses activités de trafic et de traduction du virus dans la cellule hôte. ORF3a a une structure de canal ionique qui favorise l'apoptose et l'inflammation.
Une variante commune d'ORF3a est apparue après l'introduction humaine car les isolats précoces en manquent. La présence de cette mutation modifie les séquences protéiques dans deux produits possibles du cadre de lecture. D'autres études montreront le lien fonctionnel entre les variantes et l'étendue du tropisme tissulaire montré par ces virus.
L'étude montre également des substituants d'acides aminés dans E émergeant du passage des échantillons d'origine à travers les cellules Vero. Les mutations aux positions E 5/6 (V5G / A ou S6W) sont en corrélation avec une réplication efficace uniquement dans les cellules Vero, étant fortement affaiblies dans les cellules bronchiques.
Des travaux antérieurs sur le SRAS-CoV indiquent que les variants de mutation E sont atténués dans les cellules humaines et in vivo et peuvent être utilisés pour construire des souches vaccinales. La protéine E est probablement au cœur de la réplication virale dans les cellules respiratoires humaines, en particulier ces deux positions.
Le dernier point concerne la nécessité de surveiller les préparations mères étant donné la fréquence accrue des délétions de sites de clivage de la furine lors du passage du virus à travers les cellules Vero. Sinon, cela pourrait conduire à de fausses conclusions lors de la comparaison des souches passées pour les phénotypes.
Les auteurs commentent: «Ovos travaux identifient à la fois les caractéristiques clés du génome du SRAS-CoV-2 qui sont essentielles à sa croissance dans l'épithélium respiratoire humain, ainsi que les variantes dérivées pendant la circulation humaine qui déterminent la réplication efficace et le tropisme cellulaire. »
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas examinés par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
