Dans une étude récente publiée dans la revue Nature Communicationsles chercheurs ont analysé structurellement le contrôle des nucléotides adénine et les maladies neurodégénératives dans les échangeurs ClC-3.
Étude : Bases structurelles de la régulation des nucléotides adénines et pathologie neurodégénérative dans l'échangeur ClC-3. Crédit image : Lightspring / Shutterstock
Le ClC-3, un échangeur chlorure/proton, est nécessaire au contrôle des niveaux d'énergie métabolique et est activé par l'adénosine triphosphate (ATP). Des mutations ponctuelles dans les canaux ioniques ClC-3 peuvent provoquer des troubles neurologiques chez l'homme.
La cause du gain de fonction de ces mutations reste inconnue. ClC-3, ClC-4 et ClC-5 sont des capteurs d'énergie métabolique qui contribuent à l'acidification et détournent le courant électrique de l'ATPase de type vacuolaire (V-ATPase). Les animaux knockout présentent une dégénérescence rétinienne sévère et une dégradation protéique aberrante.
Deux variantes de ClC-3 pathogènes chez l'homme, T570I et I607T, génèrent des amplitudes de courant plus élevées à des tensions transmembranaires chargées négativement, bien que le mécanisme soit inconnu.
À propos de l'étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont obtenu des structures murines dimériques de ClC-3 de type sauvage à haute résolution dans des états apo et les ont combinées avec de l'adénosine monophosphate (AMP), de l'adénosine diphosphate (ADP) et de l'ATP. Ils ont également étudié la mutation I607T dans les formes liées à l'apo et à l'ATP.
Les chercheurs ont utilisé la microscopie électronique cryogénique pour identifier les structures de ClC-3 dans différentes circonstances, en vérifiant la signification fonctionnelle des résidus de revêtement de la voie à l'aide de la mutagenèse dirigée et de l'enregistrement par patch-clamp. Pour faciliter la localisation de la membrane plasmique de ClC-3, ils ont inséré des mutations ponctuelles dans l'extrémité N et ont modifié E282 en Ala. Ils ont utilisé la biotinylation de surface et l'imagerie confocale pour étudier l'expression des mutants de ClC-3 sur les surfaces cellulaires.
Les chercheurs ont évalué l'effet de l'ATP sur le ClC-3 à l'aide du paramètre de rapport de courant, obtenu en comparant l'amplitude de courant la plus élevée obtenue après la potentialisation de l'ATP à l'amplitude initiale avant la potentialisation de l'ATP. Ils ont émis l'hypothèse que l'ATP était un potentialisateur de cet échangeur.
Ils ont examiné la structure de ClC-3 à une résolution de 3,3 Å pour comprendre les processus de liaison de l'ATP et leur potentialisation. Observant une densité supplémentaire ressemblant à l'ATP entre les deux domaines CBS intracellulaires, ils ont injecté de l'ATP dans des échantillons de protéines ClC-3 avant de les congeler pour réduire l'hydrolyse.
Les chercheurs ont effectué des simulations de dynamique moléculaire (MD) sur tous les atomes de mClC-3ATP, mClC-3ADP et mClC-3AMP pour élucider la configuration de liaison de l'ATP dans les échangeurs ClC-3. Ils ont également examiné les voies de transport des ions à l'intérieur des domaines transmembranaires et effectué une analyse de réseau dynamique.
Ils ont introduit des mutations ponctuelles dans la voie d'information mutuelle, mesurant la potentialisation de l'ATP dans ces mutants, et ils ont également résolu la structure du mutant I607T dans les états apo et liés à l'ATP.
Résultats
Concernant la structure du ClC-3, les chercheurs ont découvert des canaux conducteurs de chlorure dans les domaines transmembranaires de chaque sous-unité mClC-3apo à l'aide de plugins CAVER dans PyMOL, qui relient les lumières endosomales aux cytosols. Des résidus associés aux canaux conducteurs d'ions ClC, comme le glutamate de régulation E282, se trouvent également le long de cette voie, avec la chaîne latérale orientée vers le haut.
Les chercheurs ont découvert des densités électroniques triples, indiquant très probablement trois Cl– ions juste en dessous de E282 (ou Sext), à proximité de Y630 (ou Sin) et entre les deux (Scen), identiques à ceux de l'échangeur ClC-7. Les mutations E282 en Ala ont diminué les rectifications vers l'extérieur et augmenté l'amplitude du courant pendant l'hyperpolarisation en découplant le transport de protons et de chlorure.
La mutation de S453 dans la région Sext en Arg a démontré que les charges positives supplémentaires introduites favorisaient probablement l'enrichissement en ions chlorure chargés négativement, augmentant les courants sortants aux potentiels de membrane de type positif.
La substitution de l'acide aminé Y630A a augmenté le courant lors de la dépolarisation. Les chercheurs ont découvert une voie d'ionisation fractionnée qui commence à proximité de la région Scen et passe derrière l'hélice P et l'hélice O. E339, un glutamate protonique conservé présent dans les échangeurs ClC, a été trouvé dans l'entrée cytosolique de cette voie. La mutation de ces résidus a augmenté les courants ClC-3.
La protéine mClC-3 est restée stable pendant toute la simulation de 300 ns, avec un plateau de l'écart quadratique moyen (RMSD) à 30 ns. En comparaison, l'AMP ou l'ADP n'ont pratiquement pas augmenté le courant. L'ajout d'une concentration saturante d'ADP ou d'AMP (500 µM) a entraîné des densités électroniques dans les structures mClC-3ADP et mClC-3AMP.
La poche de liaison à l'ATP de ClC-3 a montré une forme et une séquence similaires à celles de ClC-5 et ClC-7, avec une liaison à l'ATP stabilisée par des résidus de l'extrémité N, du domaine CBS1 et du domaine CBS2. Les mutations sur ces résidus ont entraîné une potentialisation du courant par l'ATP beaucoup moins importante.
L'interaction de l'ATP a déclenché des changements de conformation dans les résidus primaires dans les domaines transmembranaires, améliorant le transport des ions Cl. Cependant, des changements dans la conductance, les probabilités d'ouverture et les expressions de ClC-3 peuvent induire des variations dans le transport des ions Cl chez les mutants. L'ajout de 10,0 mM d'ATP aux fluides de pipettes de patch dans des configurations de patch de cellules entières a amélioré la capacité de l'échangeur à contrôler ClC-3 par l'intermédiaire des nucléotides adénines.
Conclusions
L'étude a permis d'identifier la base structurelle des interactions de ClC-3 avec les nucléotides adénines, mettant en évidence son rôle de capteur d'énergie métabolique et reliant les niveaux d'énergie cellulaire à l'activité endosomale. Les chercheurs ont découvert des voies de transport des ions Cl- et H+ comparables à celles observées dans d'autres protéines ClC et des densités électroniques proches des ions Cl- et des molécules d'eau.
La mutation S453R dans ClC-3 a été associée à des anomalies du développement neurologique. Les nucléotides adénines régulent ClC-3 différemment, l'ATP se liant à ClC-3 avec une plus grande affinité. La mutation I607T est liée à la myotonie congénitale et à la neurodégénérescence à début précoce.
