Une nouvelle publication de Progrès optoélectroniques; DOI 10.29026/oea.2024.240035 traite de la nanoscopie à émission stimulée multiplexée pour l'imagerie à long terme de cellules vivantes multicolores.
Dans le domaine de la biologie cellulaire, un nombre croissant d'études se concentrent sur le réseau complexe d'interactions entre les structures subcellulaires. En tant qu'outil d'imagerie puissant, la microscopie à fluorescence à super-résolution a dépassé la limite de diffraction, permettant aux biologistes d'observer les structures subcellulaires avec une résolution à l'échelle nanométrique. Parmi les microscopies à fluorescence à super-résolution, la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED) est l'une des principales techniques au-delà de la limite de diffraction, et elle garantit des artefacts minimes grâce à ses propriétés microscopiques de super-résolution immédiate sans post-traitement.
Au cours de la dernière décennie, la nécessité d'étudier les interactions entre les structures subcellulaires a conduit à un intérêt croissant et à une application accrue de la STED multicolore sur cellules vivantes, le plus souvent obtenue en utilisant plusieurs paires de faisceaux d'excitation-déplétion. Cependant, l'augmentation du nombre de faisceaux d'épuisement rend non seulement le système plus complexe et augmente considérablement le coût de construction, mais augmente également le risque de photo-blanchiment et de photo-cytotoxicité plus grave, ce qui n'est pas propice à l'imagerie de cellules vivantes. D'autre part, l'utilisation d'un seul faisceau d'épuisement avec plusieurs faisceaux d'excitation limite la gamme des longueurs d'onde d'excitation disponibles, et la division de la bande restreinte en plusieurs canaux spectraux densément disposés et la réduction de la diaphonie entre eux posent un défi important. Actuellement, cette approche est généralement limitée à l'imagerie à deux ou trois couleurs.
Par conséquent, les chercheurs ont utilisé les informations sur la durée de vie de fluorescence pour obtenir une imagerie multicolore. La durée de vie de fluorescence est le temps moyen qu'une molécule fluorescente passe dans l'état excité et peut être utilisée pour distinguer différentes molécules fluorescentes. Cependant, la STED multicolore basée sur les durées de vie de fluorescence n'est actuellement applicable qu'aux cellules fixes en raison de la difficulté de (i) filtrer les marqueurs fluorescents de cellules vivantes avec une luminosité et des propriétés anti-blanchiment adaptées à l'imagerie STED, (ii) étiqueter simultanément plusieurs structures subcellulaires dans des cellules vivantes et (iii) séparer différentes sondes fluorescentes dans le même canal spectral en utilisant une méthode analytique appropriée. Actuellement, les biologistes sont confrontés à un manque de méthodes efficaces pour étudier la dynamique et la fonction des structures subcellulaires à l'aide de la microscopie STED.
Sur la base des défis ci-dessus, les auteurs de cet article ont développé une nanoscopie multiplexée par émission stimulée (mSTED), qui permet l'observation simultanée de davantage de structures avec un photoblanchiment et une phototoxicité limités. Les chercheurs ont examiné une série de combinaisons de sondes fluorescentes appropriées capables d'étiqueter simultanément plusieurs structures subcellulaires. Ces sondes fluorescentes de cellules vivantes avec une identité spectrale similaire ont ensuite été séparées par une analyse de phasor. mSTED a obtenu une imagerie STED de cellules vivantes à 5 couleurs et a révélé des interactions à long terme entre différentes structures subcellulaires. Les résultats ici offrent une voie pour comprendre l'interactome complexe et délicat des structures subcellulaires dans les cellules vivantes.
Les chercheurs ont d'abord testé les performances du mSTED par imagerie bicolore (Fig. 1), qui a montré qu'il pouvait séparer avec succès différentes structures subcellulaires et ne provoquait que 4 % de diaphonie. Par rapport à la microscopie confocale, la résolution du mSTED a été considérablement améliorée (~60 nm), permettant l'observation de structures subcellulaires avec des détails beaucoup plus fins.
Pour vérifier les performances de mSTED en photoblanchiment et photocytotoxicité, les chercheurs ont mené une analyse comparative avec mSTED et les méthodes STED multicolores conventionnelles (Fig. 2). Deux lasers de déplétion étaient nécessaires dans l'imagerie STED bicolore conventionnelle. Après 11 minutes d'imagerie, le signal de fluorescence des microtubules a diminué à 13,4 % de la valeur initiale et les mitochondries se sont transformées en formes gonflées et rondes, indiquant un photoblanchiment et une photocytotoxicité sévères. En revanche, mSTED n'a nécessité qu'un seul laser de déplétion. Après 11 minutes d'imagerie, le signal de fluorescence des microtubules était toujours de 31,5 % et la forme des mitochondries ne présentait pas de changements significatifs.
Les chercheurs ont utilisé la mSTED pour l'imagerie à long terme de cellules vivantes, permettant l'observation simultanée de cinq structures subcellulaires (Fig. 3). Les informations suffisamment importantes de la mSTED multicolore à long terme nous ont permis de découvrir des phénomènes intéressants en biologie cellulaire. À titre d'illustration, les microtubules maintiennent un espace sous le noyau pour que d'autres organites puissent se déplacer, et la fission et la fusion mitochondriales se produisent dans cet espace limité sous la coopération du RE et des microtubules. Ces résultats soulignent la supériorité de la mSTED multicolore dans l'imagerie à long terme de cellules vivantes de plusieurs structures, permettant en même temps l'interprétation systématique du réseau d'interaction des organites.
