La voie vers la spectroscopie moléculaire unique

Dans cette interview, Francesco Simone Ruggeri de l'Université de Cambridge parle àMa CliniqueLife Sciences de leurs recherches sur les biomolécules et des méthodes qui aident à obtenir des spectres à l'échelle d'une molécule unique.

Qu'est-ce qui vous a amené à étudier ensemble la chimie et la biologie?

Je suis physicien, et j'ai obtenu en Italie un Master en physique du solide et science des matériaux pour caractériser les matériaux photovoltaïques, donc très différents de mes recherches actuelles en biosciences. Une fois diplômé, j'ai décidé que je voulais étudier les problèmes appliqués en physique, en commençant un doctorat. à Lausanne en Suisse et étudiant le mauvais repliement et l'agrégation des protéines à l'aide de la microscopie à force atomique et des méthodes physiques appliquées générales. Ici, je me suis concentré sur l'étude du problème complexe de la neurodégénérescence.

Mes recherches étaient à l'interface entre la physique et la biologie. La partie physique impliquait la microscopie à force atomique pure et les méthodes biophysiques, et la biologie impliquait l'étude des bases moléculaires de la neurodégénérescence. Après mon doctorat, je suis passé à l'Université de Cambridge au Royaume-Uni, travaillant au Center for Misfolding Diseases où environ 100 scientifiques d'horizons très différents – de la biologie à la physique et à la chimie – étudiaient le problème du mauvais repliement des protéines et l'agrégation, qui est considérée comme l'un des processus fondamentaux liés à la neurodégénérescence.

Dans l'ensemble, mon chemin a commencé avec la physique, puis je suis passé à la biologie et plus tard à la spectroscopie, travaillant avec la chimie en cours de route.

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Pourquoi est-il important de pouvoir déterminer avec précision les propriétés chimiques et structurelles des biomolécules?

De nos jours, dans la société, il y a plusieurs grands défis complexes à résoudre, tels que les maladies humaines et la neurodégénérescence. Il est généralement admis qu'une approche interdisciplinaire est essentielle pour les résoudre. Lorsque les biosciences et la nanotechnologie ont commencé au XXe siècle, les gens étaient très enthousiastes à l'idée de pouvoir «voir» les biomolécules à l'échelle nanométrique.

Cependant, ces informations morphologiques n'étaient pas suffisantes et les gens se sont rendu compte que pour comprendre comment une biomolécule fonctionne dans notre cerveau ou dans notre corps, il est nécessaire de comprendre comment sa fonction est liée à ses propriétés structurelles et chimiques, qui définissent leur physiologie. fonction.

Quelqu'un a dit un jour que les protéines sont des acteurs du théâtre du corps, mais pour que chaque acteur ait le bon rôle, sa structure et ses propriétés chimiques doivent être bien définies.

Qu'est-ce qui a provoqué vos recherches sur les techniques d'imagerie et les biomolécules?

L'un des axes majeurs de ma recherche est de démêler les bases moléculaires de la neurodégénérescence en exploitant des approches à molécule unique. Ces maladies sont liées à un changement conformationnel (mauvais repliement) des protéines de notre cerveau (qui ont une certaine structure et propriétés chimiques). Ce changement conduit à un processus d'agrégation, qui est extrêmement hétérogène, et cela conduit à la formation de plusieurs espèces oligomères et fibrillaires amyloïdes, de nature transitoire, hétérogène et nanométrique.

Il n'est pas tout à fait clair quelles espèces amyloïdes sont impliquées dans la toxicité et impliquées dans les mécanismes moléculaires provoquant la neurodégénérescence, il est donc nécessaire de caractériser ces espèces une par une à l'échelle nanométrique pour comprendre laquelle (s) pourrait être la cause putative de la toxicité. . Pour cela, vous avez besoin d'imagerie.

Cependant, comme dit précédemment, ne regarder que leur morphologie n'est pas suffisant, il est également nécessaire de comprendre leurs propriétés chimiques et structurales à l'échelle d'une seule molécule. C'est pourquoi l'imagerie chimique et la spectroscopie à l'échelle nanométrique ont été à la fois utiles et nécessaires pour mes recherches.

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Comment les méthodes spectroscopiques ont-elles évolué au fil des ans et quelles nouvelles découvertes cela a-t-il apporté?

Il y a environ cinq ans, nous avons commencé à explorer l'application de la nanospectroscopie infrarouge en biologie à l'aide du système nanoIR1 (Bruker / Anasys Instruments) pour démontrer qu'il était capable d'étudier cette hétérogénéité dans l'agrégation de protéines. Nous avons démontré pour la première fois à l'échelle d'un seul agrégat les changements structurels moléculaires qu'une protéine subit lors de la formation de l'amyloïde.

Cependant, à l'époque, la technique ne permettait de mesurer que de grands agrégats supramoléculaires de dimensions minimales de 100 ou 200 nanomètres. De plus, il n'a pu acquérir des informations structurelles et chimiques que dans des environnements aériens.

Aujourd'hui, nous avons repoussé les limites de l'imagerie chimique et de la spectroscopie à l'échelle nanométrique jusqu'à la seule molécule à l'échelle nanométrique, toujours dans un environnement aérien. Récemment cependant, nous avons également démontré que la technique est déjà capable d'acquérir des informations chimiques à l'échelle nanométrique dans un environnement liquide, qui est un environnement beaucoup plus physiologique pour l'étude des processus biomoléculaires; ouvrant ainsi la voie à une nouvelle fenêtre d'observation sans étiquette en biologie à l'échelle nanométrique et dans des conditions physiologiques.

L'obtention de spectres d'absorption vibrationnelle au niveau d'une seule molécule pour ces biomolécules est cependant restée difficile. Pourquoi est-ce?

La partie délicate de l'étude des processus biomoléculaires est que, dans la plupart des cas, ils se produisent à l'échelle nanométrique. Les biomolécules impliquées ont des dimensions intrinsèques à l'échelle nanométrique, elles sont donc très difficiles à voir avec les méthodes de microscopie conventionnelles. Il est également difficile de les étudier avec des méthodes de spectroscopie en masse car en plus d'avoir des dimensions nanométriques, elles sont également hétérogènes.

La microspectroscopie a une résolution spatiale limitée et, en général, la microscopie ne nous permet pas de récupérer des informations sur des espèces à molécule unique – elle ne fournit que des informations sur la moyenne d'une population, ce qui n'est pas suffisant pour démêler en détail les processus biomoléculaires.

Ces dernières années, de nombreuses techniques spectroscopiques à l'échelle nanométrique ont tenté de caractériser les propriétés chimiques des systèmes biologiques à l'échelle nanométrique. Cependant, il existe actuellement un compromis entre la sensibilité et la fiabilité élevée des spectres et la facilité d'interprétation.

Sur la base de ce compromis, nous pouvons diviser les méthodes actuelles de pointe en deux catégories: les méthodes de diffusion, qui peuvent avoir une sensibilité extrême riche, mais sont souvent limitées par une complexité spectrale et une reproductibilité élevées, et qui nécessitent des modélisation pour récupérer des informations chimiques; et d'autre part, des méthodes thermomécaniques, telles que la nanospectroscopie d'absorption infrarouge (AFM-IR), qui mesurent directement et purement l'absorption IR de l'échantillon et assurent une reproductibilité et une interprétation spectrales élevées.

Cependant, jusqu'à présent, la sensibilité de la nanospectroscopie d'absorption infrarouge était limitée car il y avait des difficultés à comprendre les principes à la base de la détection thermomécanique. De plus, la technique utilise une amélioration de champ au niveau du nanogap métallique entre une pointe acérée et les substrats où les protéines sont déposées, mais comprendre comment cette amélioration de champ peut affecter les mesures a été difficile jusqu'à présent.

Dans votre recherche, vous avez introduit la technique d'imagerie ORS-nanoIR. Comment cette méthode d'imagerie pourrait-elle aider à obtenir des spectres d'absorption de biomolécules au niveau d'une seule molécule?

Il était déjà connu et rapporté dans la littérature que l'utilisation d'un nanogap métallique conduit à une amélioration du champ électromagnétique, améliorant ainsi la sensibilité des méthodes chimiques à l'échelle nanométrique. De plus, comme mentionné précédemment, la nanospectroscopie infrarouge est une méthode thermomécanique.

Qu'est-ce que cela signifie s'il y a une protéine à la surface? Dans ce cas, si nous envoyons une lumière infrarouge à la bonne fréquence, elle sera absorbée par l'échantillon. Cette absorption provoque une vibration des liaisons chimiques, et cette vibration est dissipée sous forme de chaleur, ce qui provoque une dilatation thermique de la protéine.

Pour une seule protéine, cette dilatation thermique est très faible, et nous utilisons la pointe d'une sonde de microscope à force atomique, qui est en contact avec l'échantillon, pour la mesurer. On peut démontrer que la réponse de la sonde mesurant cette expansion est proportionnelle à l'absorption IR.

Il existe deux principaux facteurs limitant la capacité de cette méthode à atteindre l’échelle de la molécule unique. Le premier est de pouvoir mesurer cette expansion, et le second est de pouvoir conserver (pas détruire) la protéine, car il y a une pointe très dure sur le dessus.

Pour résoudre ces problèmes, nous avons d'abord commencé à examiner comment l'amélioration du champ au niveau du nanomètre métallique entre la protéine et la surface peut influencer le rapport signal / bruit de la mesure. Normalement, les gens supposeraient que le fait d'avoir un laser plus puissant entraînerait un rapport signal / bruit plus élevé, car vous ajoutez plus d'amélioration. Mais nous avons découvert qu'avoir trop de puissance laser provoquerait à la place de grandes oscillations de la pointe en contact avec l'échantillon, conduisant finalement à la non-linéarité et à la destruction de l'échantillon. En abaissant complètement la puissance du laser, nous visions à éviter de détruire cette protéine très douce et à préserver la linéarité du signal.

Ensuite, nous avons également examiné comment les résonances mécaniques du cantilever pouvaient être réglées pour améliorer ce signal. Il était déjà entendu que si vous accordez votre laser IR à la même fréquence que l'oscillation du cantilever, il est possible d'améliorer le signal. Nous avons découvert que nous devions décaler la fréquence de mesure un peu plus bas afin d'être plus sensible à la protéine et moins sensible à l'or qui l'entoure, entraînant donc une amélioration du champ.

Pouvez-vous décrire les avantages de l'utilisation d'ORS-nanoIR par rapport à d'autres méthodes d'imagerie couramment utilisées, telles que la spectroscopie vibrationnelle conventionnelle? Quelle est la sensibilité de cette méthode d'imagerie?

La spectroscopie vibrationnelle ou microspectroscopie a une résolution spatiale typique de l'ordre de quelques microns, tandis qu'une seule protéine a des dimensions de l'ordre de un à dix nanomètres. La microspectroscopie vibrationnelle en masse conventionnelle ne permet pas d'étudier une seule protéine, j'ai donc développé Off-Rl'ésonance, Short Pulse et nanospectroscopie à absorption infrarouge de faible puissance (ORS-nanoIR) pour combler cette lacune technologique en utilisant le système nanoIR2 (Bruker / Anasys Instruments).

La méthode nous permettant d'acquérir avec précision des cartes chimiques et des spectres au niveau d'une seule molécule de protéine. Ensuite, l'étude de la forme et de la position de leur bande Amide nous permet de faire une caractérisation très précise de leur structure secondaire. Le principal avantage de l'ORS-nanoIR et, en général, de la détection thermomécanique, est que le spectre IR que nous acquérons est une mesure directe de la lumière absorbée par l'échantillon. Cela signifie que nous ne mesurons que et directement l'absorption infrarouge, sans aucun effet de diffusion.

La caractérisation de la structure secondaire est importante dans l'étude de la neurodégénérescence. Par exemple, la maladie d'Alzheimer ou l'apparition de la maladie de Parkinson est liée à un mauvais repliement des protéines dans le cerveau des patients, provoquant une agrégation et des modifications de leur structure secondaire. Ce changement entraîne la perte de la fonction protéique ou la séquestration d'autres biomolécules, ce qui à son tour perturbe les comportements et les voies physiologiques.

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Pensez-vous que vos résultats d'ORS-nanoIR peuvent aider à mieux identifier et caractériser ces biomolécules, ce qui à son tour aiderait à comprendre davantage de processus biochimiques?

Les processus biomoléculaires sont basés sur la relation entre les structures, l'état chimique et la fonction des biomolécules et sur la façon dont ces états changent au cours des interactions biomoléculaires. Si vous pensez à la fonction d'une cellule, il existe des centaines de processus biochimiques régulés par les membranes lipidiques et les vésicules, les protéines et les acides nucléiques. Il est nécessaire de comprendre comment ces processus se produisent au niveau d'une seule molécule.

ORS nano-IR va nous permettre de caractériser directement ces processus pour la première fois. Jusqu'à présent, aucune technique n'a été en mesure de caractériser l'interaction chimique à l'échelle d'une seule molécule de manière aussi détaillée et avec un débit aussi élevé. La technique ORS-nanoIR ouvre un tout nouveau champ d'observation en biologie sur les propriétés structurales et chimiques des biomolécules à l'échelle nanométrique d'une seule molécule.

Où voyez-vous l'avenir des méthodes d'imagerie? Quels progrès supplémentaires pourrait-on faire pour développer davantage la sensibilité de cette technique?

La technologie de pointe actuelle a atteint la sensibilité d'une molécule unique dans les environnements aériens, et nous sommes en mesure de mesurer dans des environnements liquides, mais c'est toujours à une résolution similaire aux techniques d'il y a cinq ans – de l'ordre de dizaines de nanomètres , plutôt qu'à l'échelle d'une seule molécule.

Une avancée fondamentale serait d'appliquer avec succès la nanospectroscopie infrarouge en biosciences afin d'atteindre la détection d'une seule molécule dans un environnement liquide. Je compte aborder ce problème dans mes recherches futures avec le système nanoIR3 Fluid AFM-IR (Bruker).

Quelles sont les prochaines étapes de votre recherche sur les nanoIR et les biomolécules?

Dans mon programme de recherche, je me concentre à la fois sur le développement technologique de la nanospectroscopie infrarouge et sur les applications en biosciences et biomatériaux.

Par exemple, j'ai appliqué la nanospectroscopie infrarouge pour la caractérisation de biomembranes artificielles fonctionnelles innovantes. De plus, j'ai récemment démontré que la nanospectroscopie infrarouge pouvait étudier avec succès un phénomène biologique très intéressant et nouveau, qui est le processus de séparation de phase liquide-liquide des protéines.

Jusqu'à il y a quelques années, on pensait que chaque organite d'une cellule était entouré d'une membrane lipidique, mais maintenant il est clair qu'il existe des organites capables de résoudre leur fonction physiologique sans avoir besoin d'une membrane lipidique et qui s'assemblent à travers un liquide- séparation de phase liquide. L'un des principaux objectifs de mes recherches futures est de démêler les mécanismes moléculaires de la séparation de phase liquide-liquide dans des environnements liquides physiologiques avec une résolution chimique et structurelle à l'échelle nanométrique.

En outre, je prévois d’étendre mon approche initiale des échantillons in vitro à des biopsies humaines ex vivo afin d’identifier des agrégats de protéines dans le cerveau de patients atteints de la maladie d’Alzheimer et de Parkinson. Nous pouvons alors, par exemple, utiliser les informations chimiques spectroscopiques contenues dans les spectres chimiques localisés à l'échelle nanométrique comme biomarqueurs de la maladie.

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Quelles sont les choses que vous savez de votre travail que vous souhaiteriez que plus de gens sachent?

Pour une personne externe qui examine mes recherches, qui se concentrent sur l'auto-assemblage des protéines et la neurodégénérescence, il peut sembler que notre utilisation de la nanospectroscopie infrarouge repose largement sur des applications actuelles avec peu de développement. Cependant, la démonstration de la sensibilité d'une molécule unique a déjà montré que pour résoudre des problèmes très complexes, nous devons faire progresser notre technologie de manière significative.

Ce n'est pas toujours clair, cependant, car nos productions scientifiques sont principalement liées à des travaux interdisciplinaires et sont très appliquées. J'aimerais que davantage de gens sachent que nous devons maintenant constamment étendre les capacités de la microscopie à force atomique et de la nanospectroscopie afin de résoudre des problèmes fondamentaux en bioscience.

A propos de Francesco Simone Ruggeri

Je travaille actuellement au Center for Misfolding Diseases de l'Université de Cambridge. L'objectif de mon programme de recherche original est de développer et d'appliquer de nouvelles méthodes physiques à l'interface avec la chimie et la biologie pour éclairer les processus moléculaires sous-jacents à l'apparition des troubles neurodégénératifs et étudier les biomatériaux fonctionnels pour des applications biomédicales.

Dans mes recherches, je repousse en permanence les limites des méthodes d'analyse de la biologie et de la physique modernes pour étudier des échantillons biologiques complexes et hétérogènes et des biomatériaux à l'échelle nanométrique. J'ai une expertise approfondie en microscopie à sonde à balayage, en science des surfaces, en spectroscopie, en analyse de données, en traitement d'images et en caractérisation de particules uniques.