L’entrée du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) dans les cellules hôtes est en partie médiée par le récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2).
Étude: Identification des modificateurs ACE2 spécifiques au type cellulaire par criblage CRISPR. Crédit d’image : Kateryna Kon/Shutterstock.com
L’inhibition endogène de l’ACE2 empêche l’entrée du SRAS-CoV-2 dans les lignées cellulaires permissives, tandis que l’expression hétérologue de l’ACE2 dans les lignées cellulaires non permissives les rend vulnérables à l’infection. De plus, l’expression transgénique de l’ACE2 humain rend les souris sensibles à l’infection par le SRAS-CoV-2 et imite les caractéristiques pathologiques de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19).
Le séquençage unicellulaire de l’acide ribonucléique (ARN) (ARN-seq) a été utilisé dans plusieurs études depuis le début de la pandémie de COVID-19 pour analyser l’expression de l’ACE2 dans les tissus humains et les modèles animaux. Les résultats de ces études ont montré que l’expression de l’ARN messager (ARNm) de l’ACE2 est systématiquement hétérogène entre les types de cellules dans un tissu donné.
Des recherches antérieures ont identifié deux promoteurs différents pour l’ACE2 pleine longueur qui fluctuent dans leur utilisation comparative à travers les tissus, ainsi qu’un promoteur cryptique qui pilote l’expression de l’isoforme ACE2 tronquée sensible à l’interféron (IFN).
Sommaire
Écran CRISPR pour les modificateurs HuH7 ACE2
Dans un récent Pathogènes PLOS étude, les chercheurs compilent une liste de gènes candidats pour identifier l’abondance de surface des régulateurs fonctionnels de l’ACE2. Ceux-ci comprenaient des modificateurs d’effet cytopathique du SRAS-CoV-2 identifiés dans des écrans de répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR) récemment rapportés, ainsi que des gènes proches des locus d’études d’association à l’échelle du génome humain (GWAS) associés à la sensibilité au COVID-19.
Les gènes candidats supplémentaires comprenaient ceux qui avaient été précédemment découverts par RNA-seq, dont l’association était affiliée à l’expression de l’ACE2 dans des cellules HuH7 triées, les candidats découverts dans les écrans pilotes CRISPR à l’échelle du génome de l’auteur pour l’abondance de l’ACE2, et un ensemble d’hypothèses sélectionnées manuellement gènes.
Pris ensemble, un total de 833 gènes, avec 15 ARN guides (ARNg) par gène ont été inclus dans l’étude actuelle. Le séquençage en profondeur a confirmé la variété et la reconnaissance du pool de plasmides résultant en insérant des amplicons des séquences d’ARNg regroupées dans la construction pLentiCRISPRv2.
Les cellules de type sauvage HuH7 ont été indépendamment criblées puis transduites via une bibliothèque CRISPR conçue sur mesure. Ces cellules ont ensuite été soumises à des passages pendant 14 jours et triées par cytométrie en flux en groupes désignés.
Un séquençage en profondeur a été utilisé pour déterminer l’abondance relative de chaque ARNg dans chaque groupe. L’ACE2 lui-même s’est avéré être l’un des régulateurs positifs les plus répandus de l’abondance de l’ACE2, tandis que les ARNg qui ciblent différents gènes qui ne sont pas associés à la régulation de l’ACE2 ont affiché un déclin ou un enrichissement significatif au sein des groupes triés.
Dix-neuf régulateurs positifs à haute confiance et 16 régulateurs négatifs à haute confiance de l’abondance de surface ACE2 dans les cellules HuH7 ont été trouvés. Aucun biais n’a été identifié dans les gènes contrôlant la viabilité ou la prolifération cellulaire dans les échantillons d’entrée de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) par rapport au pool de plasmides, selon l’analyse de la représentation de l’ARNg dans les échantillons d’entrée FACS.
Des niveaux élevés de concordance ont été observés parmi les résultats des cribles indépendants de cellules de type sauvage et enrichies en ACE2, indiquant ainsi la reproductibilité des modificateurs ACE2 identifiés.
Les régulateurs de l’expression génique, les réseaux fonctionnels et les facteurs hôtes viraux sont enrichis en modificateurs HuH7 ACE2
Les auteurs ont recherché un enrichissement dans les ontologies de gènes documentées et les interactions protéine-protéine parmi les 35 modificateurs ACE2 découverts par les écrans CRISPR. L’expression génique s’est avérée avoir l’enrichissement le plus élevé pour divers processus moléculaires, y compris le contrôle de la transcription, la liaison à la chromatine et la liaison à l’ADN.
Les auteurs ont comparé les résultats de l’écran ACE2 CRISPR dans les cellules HuH7 à un écran CRISPR à l’échelle du génome de l’effet cytopathique HuH7.5 lors d’une infection par le SRAS-CoV-2, ainsi que des coronavirus précédemment publiés. ACE2 était l’un des gènes les plus identifiés dans l’écran en tant que régulateur positif de l’abondance de surface ACE2 dans les cellules HuH7. L’ACE2 a également été identifié comme un facteur hôte proviral pour le SRAS-CoV-2 et pour le coronavirus humain (HCoV-)NL63.
Cependant, ce n’était pas le cas pour d’autres coronavirus qui utilisent différents récepteurs cellulaires, tels que HCoV-OC43 et HCoV-229E. Généralement, les gènes qui ont soutenu l’abondance d’ACE2 dans l’écran semblaient plus enclins à sensibiliser les cellules HuH7.5 à l’infection par le SRAS-CoV-2 et le HCoV-NL63, tandis que les gènes qui supprimaient l’abondance d’ACE2 semblaient plus enclins à fournir une résistance à l’infection par le SRAS-CoV -2 et HCoV-NL63.
Pour HCoV-229E et HCoV-OC43, cette association entre les modificateurs ACE2 et l’effet cytopathique n’a pas été observée. Ces caractéristiques supportent la pertinence de l’écran ACE2 à l’infection virale, de ce fait impliquant que même de petits changements de l’expression ACE2 peuvent effectuer la vulnérabilité cellulaire à l’effet cytopathique viral.
La susceptibilité cellulaire au SRAS-CoV-2 est modifiée par les modificateurs HuH7 ACE2
Les auteurs de l’étude actuelle ont également examiné la sensibilité des cellules HuH7 à l’infection par le SRAS-CoV-2 via la suppression médiée par CRISPR des modificateurs ACE2. 48 heures après l’infection, les cellules ciblées par CRISPR avec une expression réduite de l’ACE2 ont révélé une réduction à la fois du nombre de cellules infectées et de l’infectiosité virale, mesurée par l’immunofluorescence de la protéine nucléocapside du SRAS-CoV-2 et la dose infectieuse de culture tissulaire (TCID50).
Comparativement, l’augmentation de l’expression de l’ACE2 a entraîné une augmentation du nombre de cellules infectées par le SRAS-CoV-2 et des titres infectieux viraux. L’importance des modificateurs ACE2 détectés pour l’infection par le SRAS-CoV-2 est étayée par ces résultats, ainsi que par la concordance des données du dépistage ACE2 et du dépistage HuH7.5 SARS-CoV-2.
Conséquences
Dans cette étude, des approches génomiques fonctionnelles ont été utilisées pour examiner les voies de signalisation de l’expression de la protéine ACE2, ainsi que des modificateurs génétiques de l’expression ACE2 auparavant non signalés et un processus potentiel pour les gènes associés à l’infection par le SRAS-CoV-2. Ces résultats soulignent l’importance du type de cellule dans la régulation de l’ACE2 et fournissent des cibles potentielles pour les thérapies ciblées sur l’hôte.
